洪婧妮，蘇永全，毛 勇，孫田田，王 軍

（廈門(mén)大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門(mén)361102）

真 蛸 （Octopus vulgaris）隸 屬 于 軟 體 動(dòng) 物 門(mén)（Mollusca）、頭足綱（Cephalopoda）、八腕目（Octopoda）、無(wú)須亞目（Incirrata）、蛸科（Octopodidae）、蛸屬（Octopus），具有生活史短、生長(zhǎng)速度快、食物轉(zhuǎn)化率高、對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境和人工運(yùn)輸具有較強(qiáng)的耐受力和適應(yīng)力等諸多優(yōu)良的養(yǎng)殖生物學(xué)特性［1－2］.真蛸是暖溫種，在26℃以上水溫難于生存，有關(guān)其適宜生長(zhǎng)溫度已有所研究［3－4］.

生物體在常態(tài)下保持體內(nèi)活性氧的收支平衡，已有研究發(fā)現(xiàn)，高水溫會(huì)使變溫生物細(xì)胞吞噬活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致大量活性氧爆發(fā)［5－6］，過(guò)量的自由基如未能及時(shí)清除，會(huì)對(duì)機(jī)體的脂質(zhì)代謝、酶活性和DNA等造成嚴(yán)重?fù)p害［7］.為了避免過(guò)剩的自由基對(duì)機(jī)體造成損傷，生物體內(nèi)形成一套抗氧化系統(tǒng)，在清除過(guò)量自由基，保持機(jī)體活性氧動(dòng)態(tài)平衡中起到了重要作用［8－10］.

1957年Mills等在牛紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽（GSH）過(guò) 氧 化 物 酶 （glutathione peroxidase，GPX）［11］，之后發(fā)現(xiàn)該基因?yàn)槲?白，具 有催化 基團(tuán)——硒代半胱氨酸（Selenocysteine，Sec U）［12－13］.至今已發(fā)現(xiàn)了7種GPX種類(lèi)，其中細(xì)胞內(nèi)GPX1（cGPX）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物硒蛋白，也是目前克隆得到較多的類(lèi)型.1863年首次發(fā)現(xiàn)一類(lèi)具有分解過(guò)氧化氫作用的酶，1901年該酶被正式命名為過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT），之后通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)卟啉環(huán)是CAT的活性中心［14］.這2個(gè)基因主要在抗氧化系統(tǒng)中起到了清除過(guò)氧化氫的作用，保護(hù)生物體免受過(guò)氧化氫過(guò)量積累所帶來(lái)的損傷［15］.

本文克隆了真蛸GPX（OvGPX）和真蛸CAT（OvCAT）基因全長(zhǎng)，研究了2個(gè)基因氨基酸結(jié)構(gòu)特性，以及其在高溫條件下的表達(dá)特征，以期詮釋真蛸抗氧化酶蛋白的功能，揭示環(huán)境脅迫下OvGPX和OvCAT蛋白對(duì)于真蛸的保護(hù)作用，為真蛸的良種選育和資源保護(hù)等方面提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的暫養(yǎng)和取樣

本文所用的真蛸來(lái)自福建省霞浦縣北壁海區(qū)，帶回實(shí)驗(yàn)室以活蟹和貝類(lèi)喂食、蓄養(yǎng)1周（水溫22～24℃，鹽度26～27）后：1）選活潑正常的真蛸，取其消化腺置于由百泰克公司購(gòu)買(mǎi)的RNA fixer保存液中，4℃過(guò)夜后移入－20℃冰柜保存、備用；2）選28只健康活潑的個(gè)體，經(jīng)相應(yīng)水溫馴化恒定后，分別暫養(yǎng)在4個(gè)溫度組（24，26，28，30℃）中，每個(gè)溫度組7只個(gè)體，2h后各組隨機(jī)取3只個(gè)體，分別取其消化腺和櫛鰓，同上處理保存?zhèn)溆?

1.2 RNA提取、cDNA合成和基因全長(zhǎng)的獲得

總RNA提取利用Trizol方法，Trizol試劑購(gòu)自TaKaRa公司，具體實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.提取的RNA樣品存放于－80℃冰箱中保存，采用ND1000微量紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度；RNA第1鏈反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M－MLV 試 劑 盒 進(jìn) 行，利 用 Oligo dT－RA為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作，所得cDNA用作3′RACE模板.

反轉(zhuǎn)錄后的第1鏈cDNA，用NEB公司的RNahase試劑在37℃降解1h，加入2倍體積乙醇于－20℃ 靜置30min，4℃離心沉淀30min，加入超輕水（DDW）溶解，作為5′加尾的模板.5′加尾反應(yīng)體系為：19μL cDNA溶液，依次加入5×TdT緩沖液10μL，TdT 酶 （15U／μL）1μL，dATP（0.5mmol／L）2.5 μL，0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）牛血清白蛋白（BSA）5μL，加DDW補(bǔ)齊至50μL，試劑均購(gòu)自TaKaRa公司，37℃溫育30min，所得即為5′端模板.

利用cDNA 末端快速克?。╮apid amplification of cDNA ends，RACE）［16］的方法對(duì) OvGPX 和 OvCAT基因全長(zhǎng)進(jìn)行克隆，基因片段序列源自本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的真蛸神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)［17］，片段用于進(jìn)一步擴(kuò)增.設(shè)計(jì)參與3′RACE的特異性引物分別為GPX－F1、GPX－F2、CAT－F1、CAT－F2；5′RACE 的反應(yīng)特異性引物為 GPX－R1、GPX－R2、CAT－R1、CAT－R2（引物序列詳見(jiàn)表1）.

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，利用鷺隆公司的凝膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；將純化后的PCR產(chǎn)物利用TaKaRa公司的pMD19－T載體進(jìn)行克隆，用DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，感受態(tài)細(xì)胞試劑盒購(gòu)自鷺隆公司，具體操作步驟根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.轉(zhuǎn)化后氨芐培養(yǎng)基培養(yǎng)16h，隨機(jī)挑選6個(gè)克隆，PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠檢測(cè)后送南京金斯瑞公司測(cè)序.

1.3 序列分析和多重序列比對(duì)

通過(guò) Blast（http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）查找同源序列，利用ClustalX和Dnaman軟件進(jìn)行多序列同源比對(duì)；以O(shè)RFfinder（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／orfig.cgi）進(jìn)行開(kāi)放閱讀框（ORF）查找；在線(xiàn) Protparam （http：∥web.expasy.org／cgi－bin／protparam／protparam）軟件分析氨基酸序列組成、分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；Smart在線(xiàn)軟件、Interproscan在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)編碼蛋白的基因特征基序、功能域（http：∥www.ebi.ac.uk／Tools／pfa／iprscan／、http：∥smart.embl－h(huán)eidelberg.de／）；利用 SECISearch2.19在 線(xiàn) 軟 件 （http：∥genome.unl.edu／SECISearch.html）預(yù)測(cè)GPX是否存在硒半胱氨酸（Sec）插入序列（SECIS）結(jié)構(gòu)；利用 NetNGlyc軟件（http：∥www.cbs.dtu.dk／services／NetNGlyc／）預(yù)測(cè)GPX和CAT糖基結(jié)合位點(diǎn).

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測(cè)不同溫度下OvGPX和OvCAT的基因表達(dá)變化

為了解OvGPX和OvCAT基因在不同溫度應(yīng)激下的表達(dá)變化，本文以不同溫度組的消化腺和櫛鰓的cDNA第1鏈為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng).RNA提取和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)分別采用百泰克公司的RNA Plus試劑盒和TaKaRa公司的 PrimeScript?RT reagent Kit試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作.應(yīng)用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒，在 Rotor－gene3000熒光實(shí)時(shí)定量熱循環(huán)儀上進(jìn)行qPCR反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.合成基因特異性引物GPX－F、GPX－R、CAT－F和 CAT－R用于該實(shí)驗(yàn)，以β－actin 基因作為qPCR的內(nèi)參基因（序列見(jiàn)表1）.根據(jù)qPCR給出的Ct值，取3個(gè)平行樣本的平均值，利用2－ΔΔCt方法計(jì)算2個(gè)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量.

表1 實(shí)驗(yàn)用引物表Tab.1 Primers used in this study

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，顯著性分析水平為p＜0.05，并做柱狀圖.

2 結(jié) 果

2.1 OvGPX和OvCAT基因序列分析

以RACE方法，拼接得到OvGPX基因.得到的OvGPX cDNA全長(zhǎng)為925bp，包含5′非編碼區(qū)（5′UTR）36bp，3′非編碼區(qū)（3′UTR）316bp，ORF 573 bp，共編碼190個(gè)氨基酸，推測(cè)分子質(zhì)量21.5ku，等電點(diǎn)pI為7.81.OvGPX推導(dǎo)的氨基酸序列（圖1）含有GPX家族2個(gè)典型酶活性位點(diǎn)基序，分別是從28GKVILVENVASLUGTT43和64LGFPCNQF71；并含有特有的Sec，利用SECISearch2.19在線(xiàn)軟件在OvGPX基因的3′UTR處預(yù)測(cè)到1個(gè)SECIS，全長(zhǎng)91bp（圖2），含1個(gè)頂環(huán)和1個(gè)AG－GA SECIS核，頂環(huán)處存在保守的AAA序列.

得到的 OvCAT 全長(zhǎng)為2 109bp，包含5′UTR 135bp、3′UTR 435bp和ORF 1 539bp，共編碼512個(gè)氨基酸，推測(cè)分子質(zhì)量58.3ku，等電點(diǎn)pI為8.76（圖3）.通過(guò)功能域預(yù)測(cè)，推導(dǎo)的OvCAT氨基酸序列含有1個(gè)過(guò)CAT活性位點(diǎn)（61FNRERIPERVVHAKGAG77）、1個(gè)近端血紅素配體標(biāo)簽序列（351RLYSYSDT358）和1個(gè)酶免疫響應(yīng)區(qū)（位點(diǎn)428～494）.并發(fā)現(xiàn)了3個(gè)參與過(guò)氧化氫酶催化位點(diǎn)（His－71，Asn－144和 Tyr－354），同時(shí)預(yù)測(cè)到了3個(gè)糖基結(jié)合位點(diǎn)NASL、NYSQ、NVSS.

圖1 OvGPX的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of OvGPX cDNA

圖2 OvGPX基因的SECIS元件示意圖.2The SECIS functional element of OvGPX

2.2 OvGPX和OvCAT基因氨基酸序列同源性分析

通過(guò)Blast、Clustal X和DNAman等分析軟件，將OvGPX推導(dǎo)的氨基酸序列與8種脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的GPX氨基酸序列進(jìn)行多序列分析（圖4）.結(jié)果表明OvGPX氨基酸序列高度保守，所有比對(duì)序列基本都含有GPX的2個(gè)酶活性位點(diǎn)基序，且都有Sec.與曼氏無(wú)針烏賊（Sepiella maindroni）的 GPX氨基酸序列同源性最高（74%），與人類(lèi)（Homo sapiens）的GPX氨基酸序列同源性也達(dá)60%.

將本實(shí)驗(yàn)得到的OvCAT的氨基酸序列與8種已有動(dòng)物的CAT氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)（圖5）.結(jié)果顯示，所比對(duì)物種的CAT氨基酸序列高度保守，基本都含有CAT的特征基序和3個(gè)參與催化的殘基.比對(duì)結(jié)果顯示，不同物種相似性較高，OvCAT氨基酸序列與同是軟體動(dòng)物門(mén)的香港巨牡蠣（Crassostrea hongkongensis）和 盤(pán) 鮑 （Haliotis discus）的CAT氨基酸序列相似性高達(dá)76%和75%，與人類(lèi)的CAT氨基酸序列相似性也有68%.

圖3 OvCAT的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of OvCAT cDNA

圖4 OvGPX氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Alignment of OvGPX amino acid sequences

2.3 OvGPX和OvCAT基因mRNA在不同溫度下的表達(dá)分析

以qPCR方法分析了OvGPX基因在24，26，28和30℃不同溫度組處理2h后消化腺和櫛鰓的mRNA表達(dá)量差異（圖6）.

在消化腺和櫛鰓中，OvGPX mRNA表達(dá)量均在28℃組最高，分別達(dá)到24℃組的7.57倍（p＜0.01）和2.19倍.在30℃組，櫛鰓OvGPX mRNA的表達(dá)水平下降，只有24℃組的1／3（p＜0.05）；而消化腺中OvGPX mRNA的表達(dá)量與室溫組沒(méi)有顯著差異.

不同溫度組處理2h，真蛸消化腺和櫛鰓中OvCAT mRNA的表達(dá)量差異如圖7，在消化腺和櫛鰓中，28℃組OvCAT mRNA表達(dá)量明顯升高，分別達(dá)到24℃的2.36倍（p＜0.01）、2.13倍（p＜0.01）；在消化腺中26和30℃組的OvCAT mRNA表達(dá)量與24℃組無(wú)顯著差異；櫛鰓的OvCAT mRNA表達(dá)水平在30℃組低于24℃組，為24℃組的0.57.

不同溫度組qPCR結(jié)果表明，OvGPX和OvCAT 2個(gè)基因的表達(dá)水平在不同溫度組的表達(dá)差異相似，但是OvGPX的mRNA表達(dá)量變化波動(dòng)較OvCAT明顯.

3 討 論

本文研究得到的OvGPX cDNA全長(zhǎng)，除了具有2個(gè)高度保守的特征基序，預(yù)測(cè)的氨基酸序列中還發(fā)現(xiàn)了由UGA編碼的Sec U，這是GPX的中心催化基團(tuán)，能夠催化GSH分解體內(nèi)的氫過(guò)氧化物，從而防止細(xì)胞膜和其他生物組織遭受過(guò)氧化損傷［12－13］.UGA在一般情況下作為終止密碼子，但在OvGPX基因中，其主要編碼被稱(chēng)為第21種氨基酸的Sec［18］.該編碼依賴(lài)硒元素，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)缺乏硒時(shí)，硒蛋白的翻譯會(huì)在UGA密碼子處中止，成為不完整而沒(méi)有功能的蛋白；而破譯UGA使其編碼Sec需要SECIS元件［19］的作用，SECIS元件是一個(gè)位于GPX基因3′UTR部分的一個(gè)莖－環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，本文得到的OvGPX基因，在3′UTR區(qū)同樣發(fā)現(xiàn)了SECIS序列，這段序列由螺旋莖和頂環(huán)、內(nèi)環(huán)組成，在莖的基部具有保守的AUGAC和UGAC形成的形成非 Watson－Crick雙鏈，結(jié)構(gòu)完整，這個(gè)完整的SECIS元件保證了OvGPX基因的正確轉(zhuǎn)錄.SECIS元件的分類(lèi)主要根據(jù)保守的AAA序列是否位于頂環(huán)進(jìn)行判斷，本研究得到的OvGPX基因的SECIS元件，AAA序列位于頂環(huán)，與人類(lèi)的OvGPX1一樣屬于一類(lèi)［20－21］.

圖5 OvCAT氨基酸序列比對(duì)Fig.5 Alignment of OvCAT amino acid sequences

圖6 qPCR方法下的OvGPX在不同溫度的表達(dá)量Fig.6 The expression of OvGPX at different temperatures by qPCR

圖7 qPCR方法下的OvCAT在不同溫度的表達(dá)量Fig.7 The expression of OvCAT at different temperatures by qPCR

水生動(dòng)物受到熱應(yīng)激后的抗氧化酶的活性變化有所差異，翡翠貽貝（Perna viridis）熱激后，SOD、CAT、GST、GPX等酶活力都明顯的高于對(duì)照組［22］；雙線(xiàn)血蛤（（Hiatula diphos）和中國(guó)血蛤（Hiatula chinensis）在20～70℃不同的水溫刺激下，CAT酶活性變化趨勢(shì)表現(xiàn)為先上升，后下降，且雙線(xiàn)血蛤的變化幅度比中國(guó)文蛤明顯［23］；在對(duì)盤(pán)鮑的28℃熱應(yīng)激研究中發(fā)現(xiàn)，GPX、CAT和SOD 3個(gè)基因的mRNA表達(dá)量在熱應(yīng)激后均上調(diào)［24］.可見(jiàn)，熱激強(qiáng)度不同和熱激時(shí)間的長(zhǎng)短，對(duì)抗氧化酶活性造成的變化并不相同，而同一實(shí)驗(yàn)條件下，不同物種的GPX或CAT酶活性變化也有差異.這些結(jié)果說(shuō)明GPX和CAT這2種抗氧化酶參與熱應(yīng)激后的自由基清除活動(dòng)，保證了機(jī)體免受過(guò)度自由基損傷.本實(shí)驗(yàn)中，不同的溫度應(yīng)激后，消化腺中的OvGPX和OvCAT基因的mRNA表達(dá)量在應(yīng)激條件下均有上升，體現(xiàn)了2個(gè)抗氧化基因在熱應(yīng)激壓力下清除過(guò)氧化氫，保護(hù)機(jī)體的積極作用；櫛鰓OvGPX和OvCAT的mRNA表達(dá)量在28℃組有所升高，26和30℃組表達(dá)量下降，說(shuō)明消化腺和櫛鰓抗氧化能力可能有所不同.本文不同強(qiáng)度的熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OvGPX mRNA表達(dá)量的變化幅度明顯大于OvCAT，顯示了OvGPX對(duì)氧化應(yīng)激較為敏感.

本文克隆了OvGPX和OvCAT基因全長(zhǎng)，并探索2個(gè)基因在不同熱激強(qiáng)度下的表達(dá)情況，初步確定2個(gè)基因參與熱應(yīng)激脅迫后的抗氧化反應(yīng).這些數(shù)據(jù)為進(jìn)一步研究OvGPX和OvCAT的生物學(xué)功能提供有效信息，并為深入探索頭足類(lèi)動(dòng)物的抗氧化體系奠定理論基礎(chǔ).

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