張金丁，金蕊，楊丹丹，王亞楠，黃君健，蘇金為

1.福建農(nóng)林大學 生命科學學院，福建 福州 350002；2.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學 生物科學技術(shù)學院，遼寧 沈陽 110866

端粒是真核生物細胞染色體末端的天然保護結(jié)構(gòu)，由DNA重復序列TTAGGG和結(jié)合在端粒DNA序列上的端粒蛋白復合體組成，對穩(wěn)定基因組起到至關(guān)重要的作用[1]。端粒蛋白復合體（在哺乳類動物中被稱為shelterin）由6 個獨立的蛋白組成，分別是TRF1（端粒重復結(jié)合因子1）、TRF2、RAP1（阻抑蛋白/激活蛋白1）、TIN2（TRF1 相互作用蛋白1）、TPP1（TINT1[2]/PIP1[3]/PTOP1[4]）和Pot1（端粒保護蛋白1）。其中TRF1和TRF2 結(jié)合在雙鏈DNA 的端粒重復序列上，而Pot1 結(jié)合在單鏈懸突上，這些端粒DNA 結(jié)合蛋白通過TPP1和TIN2 的相互作用連接起來，在染色體末端保護和端粒長度調(diào)控中至關(guān)重要[5]。

有關(guān)TPP1 的研究表明，在腫瘤細胞中，TPP1 與Pot1的相互作用具有將Pot1帶入細胞核并端粒定位的功能，并在端粒末端負責聚集端粒酶，維持端粒長度的穩(wěn)態(tài)。也有相關(guān)研究表明，TPP1和TIN2 是調(diào)控裝配該蛋白復合體的關(guān)鍵元件，TRF1和TRF2 亞復合體的連接也需要TPP1和TIN2 的作用[6]。TPP1有助于穩(wěn)定TRF1-TIN2-TRF2 之間的相互作用，并促進6個蛋白復合體的形成。TPP1高表達可以加強TIN2-TRF2 的結(jié)合，敲低TPP1 后會降低內(nèi)源TRF1與TRF2復合體結(jié)合的能力，并且蛋白復合體的形成也會受到嚴重影響[5]。我們利用質(zhì)粒載體pll3.7構(gòu)建了抑制人TPP1基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）干擾載體，用于抑制端粒結(jié)合蛋白TPP1 的表達，為后期進一步研究TPP1的生物學功能提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

細胞株293T、HT1080、HepG2，大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒pll3.7（圖1），慢病毒包裝載體RRE、REV、VSVG由本實驗室保存；質(zhì)粒pCDH-Flag-Pot1、pCDHFlag-TPP1 為本課題組構(gòu)建；質(zhì)粒提取試劑盒購自Exygen公司；膠回收試劑盒購自北京天根生物公司；限制性內(nèi)切酶HpaⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ，T4DNA 連接酶均購自NEB 公司；Flag 抗體和GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗均購自Sigma 公司；Western 印跡顯色試劑盒購自Thermo 公司；核酸電泳系統(tǒng)、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)膜儀均購自Bio-Rad公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 靶向TPP1的shRNA設(shè)計

根據(jù)shRNA設(shè)計原則[5]，參考GenBank公布的人TPP1序列（NM_000391.3）,利用Invitrogen 公司在線設(shè)計軟件設(shè)計shRNA 序列（表1），進行BLAST 同源性分析，保證序列的惟一性。為方便克隆，在其5′端和3′端分別引入HpaⅠ和XhoⅠ酶切位點（為方便后期酶切鑒定，設(shè)計序列時將酶切位點的最后一個堿基削掉），反義鏈的3′端接終止信號TTTTTT，以終止轉(zhuǎn)錄。序列由英駿公司合成。

1.3 TPP1干擾載體的構(gòu)建

將合成的寡核苷酸鏈退火形成雙鏈DNA（95℃5 min，72℃10 min，自然降至室溫），同時將shRNA載體pll3.7 用HpaⅠ/XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后，把退火形成的產(chǎn)物DNA 雙鏈與酶切回收的線性化載體片段于20℃連接4 h，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將其涂布在含氨芐西林的LB 平板上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每個平板挑4 個菌落進行培養(yǎng)擴增，提質(zhì)粒，用EcoRⅠ/HpaⅠ酶切鑒定，將已插入shRNA片段的載體送北京博邁德公司測序。

1.4 慢病毒的包裝與感染

將293T 細胞接到10 cm 皿中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當細胞密度達70%～80%時，將慢病毒包裝載體RRE∶REV∶VSVG 與干擾質(zhì)粒按照4.2∶2.1∶3.1∶4μg 混合，加入氯化鈉注射用水500μL 混勻，40μL 轉(zhuǎn)染試劑PEI 中同樣加入氯化鈉注射用水500μL 混勻，然后將兩者混合均勻，靜置15 min，加入293T 細胞中，72 h 后收上清，用0.45μm的濾膜過濾，得到的上清液即為包裝好的病毒，用于感染事先準備好的穩(wěn)定表達外源蛋白Flag-TPP1 的HT1080 細胞，其余的病毒分裝于EP 管中，-80℃凍存，用于反復感染細胞，直到感染效率達90%以上。

圖1 質(zhì)粒載體pll3.7的結(jié)構(gòu)圖譜

表1 根據(jù)人的TPP1基因設(shè)計的2對shRNA序列

1.5 TPP1的shRNA干擾效果檢測

1.5.1 檢測TPP1的shRNA的干擾效果[7]將穩(wěn)定表達外源蛋白Flag-TPP1 的HT1080 細胞鋪到6 孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞密度為60%～80%時進行病毒感染，次日換液并再次感染，在倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情況。在慢病毒表達24和96 h后收取50%的細胞量，按如下程序進行Western印跡檢測。

根據(jù)樣品蛋白分子量大小選擇合適濃度的SDS-PAGE 膠進行電泳分離，電泳結(jié)束后將目的膠取下，用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上，注意濾紙、膠和膜要剪成大小一致，防止短路，上層濾紙切勿接觸到下層濾紙，轉(zhuǎn)膜電壓和時間按照目的蛋白大小進行適當調(diào)整；用5%脫脂奶粉（用1×TBST 配制）于室溫下?lián)u床封閉1 h 左右；加入用5%脫脂奶粉按一定比例稀釋的一抗，室溫輕搖1 h 或于4℃冰箱中過夜，1×TBST 洗膜3 次，每次5 min；加入用5%脫脂奶粉按一定比例稀釋的二抗，室溫輕搖1 h，1×TBST 洗膜3 次，每次5 min；按Thermo 公司的Western 印跡顯色試劑盒說明書進行顯色2～3 min，壓片顯影。

1.5.2 檢測穩(wěn)定表達外源蛋白Flag-Pot1 的端粒定位 將穩(wěn)定表達外源蛋白Flag-Pot1 的HepG2 細胞鋪到6 孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞密度為60%～80%時進行感染病毒，次日換液并再次感染，在倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情況。在熒光蛋白表達量達到80%以上時消化細胞，鋪12孔板，按如下程序進行免疫熒光試驗[8]。

將消化好的細胞用含10%胎牛血清的DMEM混勻后，接種到事先加入蓋玻片的12 孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h 后觀察細胞密度，達到70%～80%后取出12 孔板，棄DMEM 培養(yǎng)液，用1×PBS 洗1 次；每孔加入500μL 4%多聚甲醛，室溫固定10 min，棄固定液；每孔加入500μL 封閉液，室溫搖床上振蕩30 min，棄封閉液，1×PBS 洗3 次，每次5 min；按抗體說明書的要求，用1×PBS 稀釋一抗，每片蓋玻片孵25～30μL 稀釋抗體，于37℃恒溫孵育箱中結(jié)合1 h 或在4℃冰箱中過夜，在避光條件下用1×PBS 洗膜3 次，每次5 min；用1×PBS 按照一定比例稀釋DAPI，每孔加入500μL 染核液，避光染核5～10 min，熒光顯微鏡下觀察染色情況。

2 結(jié)果

2.1 TPP1的shRNA序列設(shè)計

根據(jù)人的TPP1序列設(shè)計4 條shRNA 序列（表1），經(jīng)BLAST 分析人基因數(shù)據(jù)庫序列，TPP1-si1和TPP1-si2 未發(fā)現(xiàn)同源序列，說明設(shè)計的序列特異性良好。

2.2 TPP1 shRNA干擾載體的鑒定

按前述構(gòu)建方法構(gòu)建出逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的shTPPl 質(zhì)粒，分別命名為pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2。pll3.7 空載體上有EcoRⅠ酶切位點（第4431 位堿基），同時用EcoRⅠ和HpaⅠ（第2935 位堿基）進行酶切時，可以切下1500 bp 左右的片段，而所構(gòu)建的干擾質(zhì)粒在設(shè)置酶切位點時被削掉一個堿基，載體與片段連接后無法再被識別，使得pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2 質(zhì)粒不能被HpaⅠ識別，而只被EcoRⅠ識別，單酶切成線性DNA。鑒定結(jié)果如圖2，表明外源片段shRNA 序列TPP1-si1和TPP1-si2 已插入pll3.7 載體。將測序結(jié)果與原設(shè)計的序列用DNAMAN 軟件進行比對，匹配率為100%，表明正確插入了外源片段序列。

2.3 pll-shRNA抑制TPP1蛋白表達的效果檢測

用構(gòu)建的干擾質(zhì)粒及空載體pll3.7 進行慢病毒的制備，轉(zhuǎn)染效率如圖3 所示。將制備的慢病毒pll3.7、pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2 感染高表達外源性TPP1 蛋白的HT1080 細胞，分別在表達后24和96 h 收細胞進行Western 印跡，結(jié)果用PhotoShop 7.0 軟件分析（圖4），設(shè)計的2 條shRNA 對TPP1 都有不同程度的抑制效果，且抑制效果隨感染時間的延長而增強，24 h的抑制效果分別為34.88%、30.59%，96 h 的抑制效果分別為70.56%、67.71%，其中pll-TPP1-si1對TPP1蛋白表達的抑制效果最好。

圖2 干擾質(zhì)粒雙酶切鑒定的瓊脂糖電泳

圖3 空載體pll（A）和shRNA序列（B）對293T細胞的轉(zhuǎn)染效率

2.4 shRNA 敲低TPP1 蛋白表達水平后，檢測穩(wěn)定表達外源蛋白Pot1的端粒定位

圖4 Western印跡檢測pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2病毒對高表達外源TPP1的HT1080細胞的抑制效果

圖5 熒光觀察空載體pll和pll-TPP1-si1病毒對HepG2細胞的感染效率

選取抑制效果好的pll-TPP1-si1 病毒，以空載體pll 慢病毒為對照，感染穩(wěn)定表達外源蛋白Flag-Pot1的HepG2細胞，多次感染直到感染效率達80%～90%時（圖5）將細胞鋪到12 孔板中，24 h 后進行免疫熒光試驗，結(jié)果如圖6。相關(guān)研究報道端粒蛋白Pot1 進入細胞核及端粒定位需要TPP1 的介導[9]。感染空載體pll和pll-TPP1-si1慢病毒的試驗組HepG2細胞在綠色熒光下呈現(xiàn)綠色熒光。Pot1由于內(nèi)源性TPP1 受到抑制，使得Pot1 能入核，但無法端粒定位，在紅色熒光下觀察不到端粒的點狀聚集；而對照組由于不帶有TPP1shRNA 干擾序列，不能抑制內(nèi)源TPP1 的表達水平，從而不影響Pot1 進入細胞核并端粒定位，在紅色熒光下觀察到有紅色點狀聚集。以上免疫熒光分析表明構(gòu)建的pll-TPP1-si1 干擾質(zhì)粒能有效抑制內(nèi)源性TPP1的表達。

3 討論

腫瘤細胞中的端粒及端粒結(jié)合蛋白一直是研究熱點之一。有研究報道，端粒在確?；蚪M的穩(wěn)定性和完整性上至關(guān)重要[10]，端粒內(nèi)穩(wěn)態(tài)在癌癥治療，尤其是放射治療方面具有很好的潛能[11]。哺乳動物細胞通過端粒特有的蛋白可以區(qū)分正常染色體末端，使其不被識別為損傷的DNA 而誘發(fā)ATM（ataxia-telangiectasia mutated）或ATR（ataxia-telangieetasia and Rad3 related）介導的DNA 損傷反應，出現(xiàn)DNA 損傷蛋白53BPl和γ-H2AX 在端粒的聚集，導致細胞增殖衰竭或凋亡[12]。

端粒蛋白TPP1 在Pot1 功能調(diào)控上具有多層次意義，涉及Pot1入核、入核后的端粒定位及Pot1到達端粒后最終發(fā)揮功能等多個過程步驟[5]。Pot1 蛋白在端粒上具有重要的功能，能夠保護和決定染色體DNA的5′端序列[13]。RNA干擾敲低Pot1后會導致端粒延長，出現(xiàn)染色體的不穩(wěn)定性[14]，TPP1敲低后也會出現(xiàn)類似現(xiàn)象，并抑制Pot1 募集到端粒[15]。Pot1 與TPP1 相互作用能夠調(diào)控端粒酶到達染色體末端，并且保護端粒免受DNA 損傷[4]。而且，也有體外試驗表明Pot1 與TPP1 相互作用能增強端粒酶的合成能力[16]。大多數(shù)腫瘤細胞在分裂增殖過程中保持穩(wěn)定的端粒長度，進行持續(xù)分裂[17]。因而，在腫瘤細胞中通過敲低端粒蛋白來誘導其端粒功能障礙有可能成為一種新的治療方案。

圖6 免疫熒光觀察穩(wěn)定表達Flag-Pot1的HepG2細胞感染pll和pll-TPP1-si1病毒

我們采用shRNA 設(shè)計原則構(gòu)建出2 個抑制TPP1基因的shRNA 干擾載體，Western 印跡初步鑒定能夠有效抑制TPP1蛋白的表達，并且在穩(wěn)定表達外源蛋白Flag-Pot1 的HepG2 細胞中進行了功能驗證，免疫熒光結(jié)果表明感染pll-TPP1-si1 病毒的細胞由于內(nèi)源TPP1蛋白受到抑制，從而導致其介導的Pot1 不再端粒定位?？傊?，本試驗為后期探討TPP1的生物學功能奠定了基礎(chǔ)。

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