閆楨楨 姜海琴 崔盤根 王洪生 孫建方

皮膚分枝桿菌DNA提取方法比較分析

閆楨楨 姜海琴 崔盤根 王洪生 孫建方

目的比較分枝桿菌DNA提取的常用方法。方法分別采用傳統(tǒng)的凍融法和兩種試劑盒(A、B)對不同濃度結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌和恥垢分枝桿菌純菌懸液及模擬標本進行總DNA提取。通過檢測DNA純度和PCR產(chǎn)物比較3種方法的提取效果,并應(yīng)用臨床皮膚組織標本進一步驗證。結(jié)果3種方法提取的分枝桿菌DNA均能用于PCR檢測。試劑盒A獲得的DNA純度最高,凍融法其次,試劑盒B雜質(zhì)最多;靈敏性檢測顯示3種方法可檢測出的純菌懸液最低濃度皆為102菌細胞/ml;對于模擬標本,在103菌細胞/ml時檢出率為100%,在102菌細胞/ml時試劑盒A、B和凍融法檢出率分別為60%(12/20)、55%(11/20)、55%(11/20);臨床標本檢測結(jié)果提示,試劑盒B可用于石蠟標本DNA的提取,對分枝桿菌感染組織提取率同其它兩種方法基本一致。結(jié)論試劑盒A通過多次過柱洗滌可快速獲得分枝桿菌的優(yōu)質(zhì)基因組DNA,為實驗研究及臨床檢測的首選;試劑盒B單次試劑處理除適用于石蠟標本提取DNA外,可用于新鮮組織標本的協(xié)同檢測。

分枝桿菌屬;組織提取物;DNA提取方法

作者單位:210042南京,中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所

皮膚分枝桿菌感染的致病菌種的快速檢測與鑒定對于及時有效地指導(dǎo)臨床用藥、提高療效和改善預(yù)后具有重要意義。目前,除傳統(tǒng)的鏡檢、培養(yǎng)及生化鑒定方法外,已有多種分子生物學相關(guān)技術(shù)在實驗室和臨床應(yīng)用中進行探索實踐[1-5]。隨著基因檢測技術(shù)的不斷完善及規(guī)范,以核酸檢測為基礎(chǔ)的分子診斷的重要性日益顯現(xiàn)。其中,皮膚組織中致病菌核酸的高效提取是分子診斷成功與否的先決條件。因此,我們對實驗室中常用的凍融法及兩種微生物核酸提取試劑盒進行分枝桿菌核酸提取效率的分析比較。

一、資料與方法

1.菌株來源及培養(yǎng):標準菌株結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)來自我所保存株。2012年9月至2013年11月地我所門診收集疑似臨床皮膚分枝桿菌感染標本76例。各標準株傳代,接種于改良羅氏培養(yǎng)基后,根據(jù)其最適生長溫度分別放于32℃、37℃培養(yǎng)。

2.主要試劑和儀器:GoTaq Green Master Mix,產(chǎn)自美國Promega公司;BIOWEST?瓊脂糖產(chǎn)自西班牙Biowest公司;DNA Marker B(100 bp Ladder,加拿大BBI公司);兩種DNA抽提試劑盒 QIAamp? DNA Mini試劑盒(A)、TaKaRa DEXPAT?試劑盒(B)分別產(chǎn)自德國Qiagen公司和大連寶生物工程有限公司;PCR擴增儀產(chǎn)自杭州LongGene公司;凝膠成像系統(tǒng)產(chǎn)自美國Bio-Rad公司。

3.實驗方法:

(1)引物設(shè)計:根據(jù)分枝桿菌16S rRNA DNA的保守序列區(qū)設(shè)計引物,上游引物:5'-GAGATACTCGAGTGGCGAAC-3',下游引物:5'-GGCCGGCTACCCGTGGTC-3'。擴增片段為208 bp。

(2)分枝桿菌純菌懸液的制備:方法見文獻[6],將純菌懸液依次稀釋至10～105菌細胞/ml。

(3)模擬標本的制備:模擬組織標本制備方法見文獻[7],分別按設(shè)計加入分枝桿菌菌懸液,使各管中細菌終濃度分別為10～104菌細胞/ml,制成模擬皮膚分枝桿菌感染組織標本。

4.純菌懸液和模擬標本DNA的提取:①凍融法釋放細菌DNA:每份標本取200 μl進行凍融,即液氮冷凍1min,沸水煮沸1min,反復(fù)5次,其中最后一次煮沸10min。-20℃保存?zhèn)溆?②試劑盒A、B:嚴格按各自說明書操作,其中每份標本取200 μl進行DNA提取,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.臨床標本的培養(yǎng)及DNA的提取:臨床標本組織均漿的制備見文獻[2];每份取200 μl分別采用凍融法及兩種試劑盒進行DNA提取,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6.DNA純度和濃度檢測:將不同方法獲得的基因組DNA樣本各2 μl稀釋50倍,用分光光度計在波長260 nm和280 nm下進行檢測,根據(jù)DNA的A260/A280值范圍判斷其純度。分別用3種方法測定分枝桿菌純菌懸液在105個菌細胞/ml時的吸光度值,重復(fù)20次。

7.PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件:反應(yīng)總體積為50 μl,含25 μl GoTaq Green Master Mix(含2×反應(yīng)緩沖液400 μmol/L dATP,400 μmol/L dAGP,400 μmol/L dCTP,400 μmol/L dTTP和 3 mmol/L MgCl2),上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μl,DNA模板2 μl,加無菌去離子水至50 μl。94℃5min預(yù)變性后,94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,共進行35個循環(huán),最后72℃延伸5min。擴增產(chǎn)物采用15 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳,每個加樣孔點樣6 μl,電泳緩沖液為1×TAE,恒壓180 V,電泳20min。電泳結(jié)束后,在凝膠成像儀上紫外線透射下觀察結(jié)果并攝片;模擬皮膚分枝桿菌感染標本重復(fù)20次,疑似皮膚分枝桿菌感染標本重復(fù)3次。

8.統(tǒng)計學處理:采用SPSS10.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。3種方法提取DNA質(zhì)量比較采用方差分析,陽性率比較采用χ2檢驗,方法一致性采用Kappa檢驗。檢驗水準為0.05。

二、結(jié)果

1.分枝桿菌DNA提取效果的檢測:用紫外分光光度計檢測經(jīng)凍融法和試劑盒A、B提取的基因組DNA,3組DNA的A260/A280值分別為 1.60± 0.03、1.81± 0.06、0.53± 0.07(F=4434.89,P＜0.01),濃度分別為(62±4.82)mg/L,(24±0.67)mg/L,(225±15.06)mg/L;提示試劑盒A提取的分枝桿菌基因組DNA純度最好,凍融法稍低,試劑盒B含雜質(zhì)最多。

2.分枝桿菌純菌懸液及模擬標本PCR檢測結(jié)果:不同濃度純菌懸液的PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果(圖1,2)顯示,3種方法提取的分枝桿菌DNA均可進行PCR反應(yīng),產(chǎn)物經(jīng)測序驗證為結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌和恥垢分枝桿菌;對純菌懸液的DNA提取后,可檢測的最低細菌濃度均為102菌細胞/ml濃度;而對于模擬標本,可檢測的最低細菌濃度為103菌細胞/ml濃度,當濃度在102菌細胞/ml時試劑盒A、B和凍融法檢出率分別為60%(12/20)、55%(11/20)、55%(11/20),差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.136,P＞0.05)。相同濃度下培養(yǎng)檢出率為75%。

3.疑似皮膚分枝桿菌感染的臨床標本PCR檢測及培養(yǎng)結(jié)果:76份疑似皮膚分枝桿菌感染的臨床標本經(jīng)培養(yǎng)后,12份標本陽性(結(jié)核分枝桿菌4例,海魚分枝桿菌5例,偶遇分枝桿菌1例,膿腫分枝桿菌1例,嗜血分枝桿菌1例);凍融法、試劑盒A和試劑盒B直接提取組織標本中的DNA后PCR檢測分別有8、9、9份標本陽性,其中凍融法提取陽性的8份經(jīng)試劑盒A、B提取均為陽性;1例嗜血分枝桿菌和1例結(jié)核分枝桿菌僅分別通過試劑盒A、B提取成功,嗜血分枝桿菌患者的首次培養(yǎng)結(jié)果為陰性,因菌種的分子鑒定提示為該菌,予以含紅細胞的特殊培養(yǎng)基進行2次培養(yǎng)后獲得陽性結(jié)果。3種方法同培養(yǎng)法的符合率分別為94.74%、96.05%、96.05%,差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.087,P＞0.05)。3種方法間的吻合度kappa值分別為0.934、0.934和0.874,具有較高的吻合度(均P＜0.01)

圖1 恥垢分枝桿菌純菌懸液不同方法DNA提取后PCR檢測M:標準參照物;1:陰性對照;2～4:凍融法提取,純菌懸液濃度依次為103、102、10菌細胞/ml;5～7:試劑盒A提取,純菌懸液濃度同前;8～10:試劑盒B提取,純菌懸液濃度同前

圖2 恥垢分枝桿菌模擬臨床標本不同方法DNA提取后PCR檢測 M:標準參照物;1～4:凍融法提取,模擬臨床標本濃度依次為 104、103、102、10菌細胞/ml;5 ～ 8:試劑盒 A 提取,模擬臨床標本濃度同前;9～12:試劑盒B提取,模擬臨床標本濃度同前

三、討論

常用的凍融法是在低滲環(huán)境下造成細胞裂解,通過高溫煮沸使細胞蛋白質(zhì)變性,暴露出DNA從而進行提取。所提取DNA完整性受到一定破壞,且欠缺雜質(zhì)去除過程,一定程度上會抑制PCR反應(yīng);試劑盒A為多次實驗驗證的DNA標準純化提取方法[4],其中所含優(yōu)化的緩沖液能有效裂解樣本,穩(wěn)定核酸,促進DNA選擇性結(jié)合到硅膠膜。通過反復(fù)洗滌過柱可去除PCR抑制劑(二價陽離子、蛋白等),但同時增加了DNA損耗量。該方法獲取DNA產(chǎn)物純化度最佳,基本可滿足多數(shù)常用的下游實驗研究。試劑盒B步驟簡易,僅需加入一種獨特的表面活性劑與吸附PCR反應(yīng)抑制物樹脂的混合制劑。其操作過程DNA丟失較少,但所用為回收制劑而非純化制劑故純化度較差。

本研究選擇分枝桿菌3類菌的標準菌株(結(jié)核、麻風和非結(jié)核分枝桿菌),同步驗證實驗室常用的3種分枝桿菌DNA提取方法并將結(jié)果進行比較分析。我們發(fā)現(xiàn)凍融法省時低耗,檢測純菌懸液靈敏度同試劑盒法基本一致,但獲得的DNA純度不及試劑盒A。將兩種試劑盒方法相互比較:在操作方面,試劑盒B較試劑盒A簡便省時,但前者煮沸過程若EP管錫箔紙封口不嚴或過于嚴密內(nèi)壓快速增加則容易導(dǎo)致管口泄露樣本被污染;靈敏性方面,在提取純菌菌液及模擬標本時兩者基本一致。對于臨床樣本,未觀察出兩者檢出率存在明顯的統(tǒng)計學差異,部分結(jié)果的不一致可能同所檢測組織中所含菌量不同有關(guān)。由于標本量相對較少,需進一步驗證。

[1]張彩萍,丁克云,王洪生,等.PCR-RELP法直接檢測分枝桿菌皮膚感染的臨床應(yīng)用[J].中國麻風皮膚病雜志,2013,29(3):158-161.

[2]蔡林,趙亭,張建中.PCR-RELP分析鑒定皮膚組織中的分枝桿菌[J].中華皮膚科雜志,2007,40(6):353-355.

[3]Aldous WK,Pounder JI,Cloud JL,et al.Comparison of six methods of extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from processed sputum for testing by quantitative real-time PCR[J].J Clin Microbiol,2005,43(5):2471-2473.

[4]Leung ET,Zheng L,Wong RY,et al.Rapid and simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis complex and Beijing/W genotype in sputum by an optimized DNA extraction protocol and a novel multiplex real-time PCR[J].J Clin Microbiol,2011,49(7):2509-2515.

[5]K?ser M,Ruf MT,Hauser J,et al.Optimized DNA preparation from mycobacteria[J/OL].Cold Spring Harb Protoc,2010,2010(4):pdb.prot5408[2013-12-10].http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5408.short.

[6]李曉杰,吳勤學,劉訓荃.鳥分支桿菌聚合酶鏈反應(yīng)檢測的研究[J].中華皮膚科雜志,2003,36(12):679-681.

[7]王洪生,李曉杰,吳勤學,等.PCR直接檢測皮膚分枝桿菌感染的研究[J].中華皮膚科雜志,2006,39(10):593-595.

2014-01-13)

(本文編輯:尚淑賢)

Comparison of three methods for the extraction of mycobacterial DNA

Yan Zhenzhen,Jiang Haiqin,Cui Pangen,Wang Hongsheng,Sun Jianfang.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

s:Wang Hongsheng,Email:whs33@vip.sina.com;Sun Jianfang,Email:sunjf@163.com

ObjectiveTo compare three methods for the extraction of mycobacterial DNA.MethodsTwo commercial DNA extraction kits and an ordinary freeze-thawing method were used to extract DNA from the pure suspensions of three species ofMycobacteria(M.tuberculosis,M.lepraeandM.smegmatis)at different densities(1×10 to 1×105cells/ml),simulated clinical specimens containing different concentrations of mycobacterial cells(1×10 to 1×104cells/ml).The purity and concentration of the extracted DNA were evaluated.Then,PCR was performed to amplify the 16S rRNA region ofMycobacteria.The performance of the three methods was compared by the purity and concentration of extracted DNA as well as the results of PCR.Further more,76 clinical skin specimens suspected to be infected withMycobacteriawere used to further validate the performance of these methods.ResultsAll the extracted DNA samples could be detected by PCR.The highest purity of DNA was obtained by the kit A,followed sequentially by the freeze-thawing method and the kit B.When pure suspensions were used,the detection limit was consistently 1×102cells/ml for all the three methods.With simulated specimens,the detection rate was consistently 100%for all the three methods at the concentration of 1×103cells/ml,60%(12/20),55%(11/20)and 55%(11/20)for the kit A,kit B and freeze-thawing method respectively at the concentration of 1×102cells/ml.The analysis of clinical specimens showed that the kit B could be used to extract DNA from paraffin-embedded specimens,with the detection rate similar to that of kit A and freeze-thawing method.ConclusionsThe kit A could rapidly yield high-quality genomic DNA ofMycobacteriaby repeated cleaning of columns,and may serve as the optimal method for scientific and clinical studies,and the kit B is suitable for extracting mycobacterial DNA from fresh tissue specimens besides paraffin-embedded specimens.

Mycobacterium;Tissue extracts;DNA extraction methods

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.016

衛(wèi)生部部屬(管)醫(yī)院臨床學科重點項目(2010-2012-125)

王洪生,Email:whs33@vip.sina.com;孫建方,Email:sunjf@163.com