張洋 陳官芝 朱桂芝 湯占利 陳宏泉 郭小燕

藥疹患者人類皰疹病毒7型感染的檢測(cè)

張洋 陳官芝 朱桂芝 湯占利 陳宏泉 郭小燕

目的探討人類皰疹病毒7型(HHV-7)感染在藥疹發(fā)病中的作用。方法收集50例藥疹患者(其中重型藥疹15例)及50例健康人外周血,采用PCR檢測(cè)外周血單一核細(xì)胞中HHV-7 DNA特異性片段;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清HHV-7 IgM水平。結(jié)果50例藥疹患者HHV-7 DNA陽(yáng)性率(82.00%,41例)高于健康對(duì)照組(62.00%,31例),兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.96,P＜0.05);重型藥疹患者(93.33%,14/15)、輕型藥疹患者(77.14%,27/35)及健康對(duì)照組HHV-7 DNA陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.32,P＜0.05),其中重型組高于對(duì)照組(q=3.50,P＜0.05);重型藥疹患者急性期與恢復(fù)期HHV-7 DNA陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。藥疹患者HHV-7 IgM水平(69.3190±25.2897 ng/L)高于健康對(duì)照組(59.7853±22.4382 ng/L,t=1.99,P＜0.05);輕型藥疹(65.4791±21.3261 ng/L)、重型藥疹(74.3407±31.4112 ng/L)及健康對(duì)照組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。HHV-7 DNA陽(yáng)性與陰性藥疹患者HHV-7特異性IgM水平(分別為63.7481±27.2391 ng/L、65.5802±36.2584 ng/L)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論藥疹患者中存在HHV-7活動(dòng)性感染,HHV-7感染可能是藥疹發(fā)病或加重的因素。

藥疹;皰疹病毒7型,人

作者單位:266000青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科(張洋、陳官芝、湯占利、陳宏泉);青島市中心醫(yī)院皮膚科(朱桂芝);菏澤市鄆城縣人民醫(yī)院(郭小燕)

藥疹是藥物進(jìn)入人體后引起的皮膚、黏膜反應(yīng)。感染等環(huán)境因素可直接影響機(jī)體對(duì)藥物的反應(yīng)或通過(guò)修飾藥物相關(guān)抗原使其具有免疫原性,在藥疹的發(fā)病中有著重要意義[1]。近年來(lái)藥疹的病毒感染因素受到高度重視?；顒?dòng)性病毒感染可改變機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能,提高免疫系統(tǒng)的敏感性[2]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在藥物超敏反應(yīng)綜合征(DIHS)患者中可以觀察到人類皰疹病毒(HHV)的相繼激活增殖[3]。我們的前期研究結(jié)果表明,EB病毒和HHV-6感染與藥疹的發(fā)生相關(guān)[4-5]。本研究采用PCR技術(shù)檢測(cè)外周血單一核細(xì)胞中HHV-7 DNA特異性片段,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清HHV-7特異性IgM水平,探討HHV-7感染在藥疹發(fā)生中的作用。

材料與方法

1.臨床資料:50例藥疹患者作為藥疹組,均來(lái)自2011年9月至2013年3月青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科住院病例,其中女27例,男23例,年齡14～70(42.17±16.52)歲。所有患者均有明確的服藥史,在服藥后2 h至21 d(平均4.73 d)出現(xiàn)皮疹,符合藥疹的診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)[1]。其中重型藥疹15例,包括DIHS 1例、Steven-Johnson綜合征5例、大皰性表皮松解型藥疹7例、剝脫性皮炎2例;輕型藥疹35例,包括固定型4例、麻疹型或猩紅熱型17例、蕁麻疹型9例、多形紅斑型5例。致敏藥物包括:青霉素或頭孢類抗生素17例,占34.00%;磺胺類5例,占10.00%;解熱鎮(zhèn)痛藥11例,占22.00%;抗癲癇藥6例,占12.00%;別嘌醇2例,占4.00%;中藥或中成藥9例,占18.00%。選擇同期健康體檢者50例作為健康對(duì)照組,其中男、女各25例,年齡16～67(42.53±14.25)歲。兩組性別和年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究通過(guò)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有受試對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

2.標(biāo)本制備:采集藥疹患者急性期(發(fā)疹2～7 d)與健康對(duì)照晨起空腹靜脈血3 ml,EDTA抗凝,提取外周血單一核細(xì)胞DNA,操作方法按試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,-20℃保存?zhèn)溆?同時(shí)采集藥疹患者與健康對(duì)照晨起空腹靜脈血3 ml,分離血清,-80℃保存用于ELISA。發(fā)疹10～15 d后(恢復(fù)期),15例重型藥疹患者第2次采抗凝血提取DNA,方法同前。

3.PCR檢測(cè)外周血單一核細(xì)胞中HHV-7 DNA:參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)HHV-7特異性引物,引物由美國(guó)Life Technologies公司合成,HHV-7上游引物序列:5'-CCCAACTATTTACAGTAGGGTTGGTG-3',下游引物序列:5'-TTTAGTTCCAGCACTGCAAT CG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物124 bp。反應(yīng)體系為25 μl,含2×HotMaster PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)12.5 μl,上下游引物各 1 μl,模板 2 μl,ddH2O 8.5 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min;然后95℃10 s,60℃30 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5min。每份標(biāo)本均做3次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn),每次實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照DNA分別來(lái)自HHV-7標(biāo)準(zhǔn)株感染的陽(yáng)性和陰性SUPT-1淋巴細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)株,由南京醫(yī)科大學(xué)姚堃教授惠贈(zèng),空白對(duì)照用ddH2O替換模板DNA。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠電泳(120 V,40min),凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

4.ELISA法檢測(cè)血清HHV-7特異性IgM水平:試劑盒為美國(guó)BD公司產(chǎn)品,具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,每份標(biāo)本均做3個(gè)復(fù)孔。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,定量檢測(cè)結(jié)果以±s表示,2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),3組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,定性數(shù)據(jù)用率表示,組間率的比較采用χ2檢驗(yàn),組間的多重比較采用q檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1.HHV-7 DNA檢測(cè)結(jié)果:50例藥疹患者中41例HHV-7 DNA陽(yáng)性,陽(yáng)性率82.00%,健康對(duì)照組31例陽(yáng)性,陽(yáng)性率62.00%,兩組陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.96,P＜0.05)。重型藥疹組15例中14例陽(yáng)性(93.33%),輕型藥疹組35例中27例陽(yáng)性(77.14%),健康對(duì)照組陽(yáng)性率62.00%,3組陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.32,P＜0.05),其中重型藥疹組高于對(duì)照組(q=3.50,P＜0.05)。重型藥疹組患者急性期HHV-7 DNA陽(yáng)性率高于恢復(fù)期(73.33%,11/15),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HHV-7 DNA特異性片段擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度124 bp,部分標(biāo)本電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 HHV-7 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖1:標(biāo)準(zhǔn)參照物;2～5:目的基因

2.HHV-7特異性IgM抗體檢測(cè)結(jié)果:藥疹患者組HHV-7特異性IgM抗體水平(69.3190±25.2897ng/L)高于健康對(duì)照組(59.785 3±22.438 2 ng/L),兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.99,P＜0.05);重型藥疹組(74.340 7±31.411 2 ng/L)、輕型藥疹組(65.479 1±21.326 1 ng/L)及健康對(duì)照組HHV-7 IgM抗體水平依次遞減,經(jīng)單因素方差分析,組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.32,均P＞0.05)。

3.HHV-7 DNA陽(yáng)性與陰性藥疹患者HHV-7特異性IgM抗體檢測(cè):HHV-7 DNA陽(yáng)性的41例藥疹患者HHV-7特異性IgM抗體水平(63.748 1±27.239 1 ng/L)與HHV-7 DNA陰性的9例藥疹患者(65.580 2±36.258 4 ng/L)相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.17,P＞0.05)。

討 論

藥疹的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,對(duì)抗生素過(guò)敏多發(fā)生在治療某種疾病時(shí)應(yīng)用抗生素,很少發(fā)生于應(yīng)用抗生素預(yù)防某些疾病的健康人中。感染等環(huán)境因素可直接影響機(jī)體對(duì)治療藥物的反應(yīng)或改變藥物有關(guān)抗原變?yōu)槊庖咴?其在藥疹的發(fā)病中有重要意義[1]。有報(bào)道藥疹的發(fā)生與病毒感染有關(guān),特別是人類皰疹病毒和HIV[4]。這些病毒在體內(nèi)可互相聯(lián)系,一種病毒的激活復(fù)制可導(dǎo)致其他病毒的激活復(fù)制[7]。LeClaire等[8]報(bào)道的傳染性單核細(xì)胞增多癥患者使用氨芐西林等抗生素治療,常導(dǎo)致全身性麻疹樣皮疹,當(dāng)急性期消退后再用這些藥物治療,皮疹不復(fù)發(fā)。Kano等[3]研究發(fā)現(xiàn),DIHS患者的癥狀于停用原因藥物之后仍持續(xù)發(fā)展并轉(zhuǎn)為遷延化,原因除了特定的藥物及遺傳因素之外,此類患者體內(nèi)存在潛伏感染病毒的再激活,主要是人皰疹病毒。Eliaszewicz等[9]發(fā)現(xiàn),HIV感染者藥物反應(yīng)的發(fā)生率比健康人要高,尤其在艾滋病中,嚴(yán)重的藥物反應(yīng)例如,Steven-Johnson綜合征和中毒性表皮壞死松懈癥與正常人相比大幅度增加。

本研究結(jié)果顯示,藥疹患者組HHV-7 DNA陽(yáng)性率高于健康對(duì)照組;與健康對(duì)照比較,HHV-7 DNA陽(yáng)性率有隨藥疹病情加重升高趨勢(shì),且重型藥疹患者恢復(fù)期HHV-7 DNA陽(yáng)性率較急性期有下降趨勢(shì),提示HHV-7感染可能與藥疹有關(guān),HHV-7可能為導(dǎo)致藥疹發(fā)病或加重的一個(gè)危險(xiǎn)因素。

藥疹患者血清中病毒特異性抗體的測(cè)定作為研究病毒與藥疹關(guān)系的有效手段已被國(guó)外學(xué)者廣泛應(yīng)用,HHV-7特異性IgM抗體的出現(xiàn)提示活動(dòng)性HHV-7感染。本研究結(jié)果顯示,藥疹患者組與健康對(duì)照組IgM水平有差異,提示藥疹患者可能存在新近或活動(dòng)性HHV-7感染。

本研究中,HHV-7 DNA陽(yáng)性藥疹患者HHV-7特異性IgM抗體水平與HHV-7 DNA陰性藥疹患者相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示外周血單一核細(xì)胞HHV-7 DNA與機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)HHV-7編碼產(chǎn)物產(chǎn)生IgM抗體之間并不一定是平行的關(guān)系,推測(cè)可能有以下原因:①病毒由潛伏狀態(tài)轉(zhuǎn)為活動(dòng)性感染,造成機(jī)體免疫功能紊亂;②HHV-7在淋巴細(xì)胞中主要是以潛伏感染的形式存在,隨著淋巴細(xì)胞的有絲分裂而復(fù)制,病毒拷貝數(shù)增加的同時(shí)不編碼產(chǎn)生HHV-7溶解性抗原,也就不引起機(jī)體的抗體反應(yīng),從而逃避了細(xì)胞毒性T細(xì)胞的識(shí)別和殺傷;③游離的HHV-7一旦釋放入血很容易被機(jī)體細(xì)胞免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除,因此在血清中存在的時(shí)間可能很短,而HHV-7抗原引起的抗體反應(yīng)需要一定的時(shí)間才能發(fā)生,所以兩者不能完全同步出現(xiàn);④本研究多數(shù)患者一般在發(fā)疹2～7 d采集標(biāo)本,此時(shí)HHV-7特異性IgM的抗體效價(jià)較低。

本研究結(jié)果提示,藥疹患者中存在HHV-7的活動(dòng)性感染和DNA陽(yáng)性率增加,HHV-7感染可能是影響藥疹發(fā)病及加重的環(huán)境因素之一。HHV-7感染與藥疹致敏藥物及嚴(yán)重程度的關(guān)系、各型皰疹病毒感染在藥疹患者所占地位等諸多問(wèn)題,可能需要定量PCR、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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2013-09-30)

(本文編輯:顏艷)

Detection of human herpesvirus type 7 infection in patients with drug eruptions

Zhang Yang*,Chen Guanzhi,Zhu Guizhi,Tang Zhanli,Chen Hongquan,Guo Xiaoyan.*Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Medical College,Qingdao University,Qingdao 266000,China

Chen Guanzhi,Email:chenguanzhi@outlook.com

ObjectiveTo investigate the role of human herpesvirus type 7(HHV-7)in the development of drug eruptions.MethodsVenous blood samples were collected from 35 patients with mild drug eruptions at acute stage,15 patients with severe drug eruptions at both acute stage and remission stage,as well as 50 healthy human controls.PCR was performed to detect HHV-7 DNA in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs),and enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)to determine the titer of anti-HHV-7 IgM antibody in serum.Statistical analysis was carried out byttest,one way analysis of variance,Chi-square test andqtest.ResultsThe detection rate of HHV-7 DNA was significantly higher in these patients with drug eruptions than in the healthy controls(82.00%(41/50)vs.62.00%(31/50),χ2=4.96,P＜ 0.05),different among patients with severe drug eruptions(93.33%(14/15)),patients with mild drug eruptions(77.14%(27/35))and the healthy controls(χ2=6.32,P＜0.05),higher in the patients with severe drug eruptions than in the healthy controls(q=3.50,P＜0.05),but not significantly different between the patients with severe drug eruptions at acute stage and those at remission stage(73.33%(11/15),P＞0.05).The anti-HHV-7 IgM antibody titer was significantly increased in the patients with drug eruptions compared with the healthy controls((69.319 0±25.289 7)ng/L vs.(59.785 3±22.438 2)ng/L,t=1.99,P＜0.05),but no significant difference was observed among the patients with severe drug eruptions(74.340 7±31.411 2)ng/L),patients with mild drug eruptions((65.479 1±21.326 1)ng/L)and healthy controls(P＞0.05)or between HHV-7 DNA-positive patients((63.748 1±27.239 1)ng/L)and-negative patients((65.580 2±36.258 4)ng/L,P＞0.05).ConclusionsActive HHV-7 infection exists in patients with drug eruptions,and may be associated with the development and aggravation of this entity.

Drug eruptions;Herpesvirus 7,human

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.006

陳官芝,Email:chenguanzhi@outlook.com