李 博，王元剛，李 娟，湯海峰，程 光*

(第四軍醫(yī)大學 西京醫(yī)院 1.神經(jīng)外科； 2.藥劑科，陜西 西安 710032)

研究論文

白頭翁皂苷D誘導U87MG細胞凋亡

李 博1，王元剛1，李 娟1，湯海峰2，程 光1*

(第四軍醫(yī)大學 西京醫(yī)院 1.神經(jīng)外科； 2.藥劑科，陜西 西安 710032)

目的探討白頭翁皂苷D對人腦膠質瘤細胞系U87的增殖抑制和促凋亡效應及其機制。方法用MTT法檢測細胞增殖抑制作用，并求得IC25、IC50和IC75，按濃度和時間分組，Annexin-Ⅴ/PI雙染、流式細胞術和TUNEL/PI染色檢測凋亡，Hoechst33342染色、透射電子顯微鏡、DNA-ladder檢測細胞系改變，細胞免疫染色和Western blot檢測相關凋亡蛋白表達。結果白頭翁皂苷D在14.016 nmol/mL下對U87MG抑制率為94.034%(Plt;0.05)；處理組細胞形態(tài)呈凋亡改變，細胞超微結構中發(fā)現(xiàn)自噬小體；處理組caspase-3、8、Bax和FasL表達上調(Plt;0.05)，Bcl-2表達下調(Plt;0.05)。結論白頭翁皂苷D對U87MG細胞有呈時間和濃度依賴的增殖抑制作用，且通過FasL/Fas途徑誘導其發(fā)生凋亡。

白頭翁皂苷D；增殖抑制；凋亡；細胞周期

神經(jīng)系統(tǒng)中，惡性膠質瘤是最常見的一種腫瘤[1]。其過高的患病率及極短的中位生存期，給社會尤其是患者家庭帶來較大的負擔。白頭翁湯有清熱解毒、明目、消贅和止痢的功效[2]。白頭翁皂苷D

在前期單體藥物篩選中表現(xiàn)出較強的抑制腫瘤細胞增殖的能力。本實驗觀察白頭翁皂苷D對U87MG的增殖抑制作用和致凋亡機制，為其作為臨床抗腫瘤新藥提供理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人源性膠質母細胞瘤系U87MG、EVC304細胞、正常星形膠質細胞(美國標準細胞庫，ATCC)。

太白銀蓮花(anemone taipaiensis)提取物單體W-6即白頭翁皂苷D(pulsatilla saponin D)由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥劑科提供，純度達98%以上。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組:U87MG、EVC304細胞置于10%胎牛血清、0.2% NaHCO3、0.3%羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)的DMEM培養(yǎng)基中，于恒濕孵箱中培養(yǎng)；NA細胞置于20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。于對數(shù)生長期進行實驗。MTT中，按0.219、0.438、0.876、1.752、3.504、7.008、14.016和28.032 nmol/mL濃度梯度設定，U87MG處理24和72 h，EVC304和NA處理72 h；設定空白對照組；設定DMSO組；每組5個副孔。求得IC25、IC50及IC75值。

1.2.2 樣品的制備：純度大于98%的白頭翁皂苷D晶體被二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解，制成1 000 μmol/L的貯存液，于-20 ℃保存。使用時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，且DMSO含量小于5‰。

1.2.3 MTT法檢測U87MG細胞增殖: 取0.5 g MTT粉劑，溶解于100 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)中。將U87MG、EVC304和NA細胞，用培養(yǎng)液稀釋成2×104/mL的懸液；加入96孔培養(yǎng)板。加入20 μL MTT液；加DMSO后微振蕩；在490 nm下，測定板內吸光度(absorbance，A)值；除去調零組A值，以公式[抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%]；求得每組A值，6次重復實驗，統(tǒng)計分析并求得U87MG的IC25、IC50和IC75值。

1.2.4 Hoechst33342染色檢測細胞系改變：將U87MG及EVC304細胞種植于24孔培養(yǎng)板。因化療藥物多采用靜脈滴注，故EVC304作為陽性對照組；加藥處理后，PBS洗滌，每孔加入0.5 mL Hoechst33342染液，避光孵育15 min；熒光顯微鏡下檢測。

1.2.5 Annexin-Ⅴ/PI 染色標記凋亡細胞：按IC25、IC50和IC75，用白頭翁皂苷D處理U87MG細胞12 h；吸取100 μL細胞到1.5 mL離心管中，加入5 μL的Annexin-Ⅴ-FITC和5 μL的PI染色；避光混勻，在室溫下孵育15 min；流式送檢。

1.2.6流式細胞技術檢測細胞周期：70%的冰乙醇與PBS制備單細胞懸液；PBS洗滌并重懸，4 ℃過夜；用RNaseⅠ(0.1 mg/mL)和PI(40 μg/mL)在37 ℃孵育30 min；上機檢測。

1.2.7 透射電子顯微鏡技術檢測細胞超微結構：U87MG細胞在IC50濃度下處理12和16 h；收集細胞懸液，1 000r/min離心；3%的戊二醛4℃固定；10 g/L鋨酸固定；后脫水、包埋、超薄切片和雙染色(鉛/鈾)；透射電鏡下觀察。

1.2.8 TUNEL/PI染色檢測細胞凋亡：制備5×103/mL細胞懸液，加入放有蓋玻片的6孔板內；加入IC50；分別處理12和16 h； 0.4%的多聚甲醛固定30 min； 0.3% H2O2避光處理20 min；Triton X-100(0.15%)破膜；滴加TUNEL混合物(1∶9)；在37 ℃避光潮濕條件下孵育1 h；再加入PI(1∶1 000)。熒光顯微鏡下觀察。

1.2.9 DNA-ladder檢測DNA片段：本實驗采用羅氏公式的DNA-ladder檢測試劑盒；按IC50、IC75分別處理U87MG 12和16 h；按照說明書，異丙醇法提取備用。制備瓊脂糖凝膠；在電壓80～100 V間電泳1 h；紫外光透射儀下觀察。

1.2.10 細胞免疫組化染色檢測caspase8表達：將細胞載玻片用0.15% Txiton X-100處理15 min,除去內源性過氧化物酶,高壓抗原修復,用SABC試劑盒中的血清經(jīng)行抗體封閉,按caspase8，1∶30(兔抗人)配制一抗,潮濕環(huán)境過夜。加二抗,滴加辣根過氧化物酶卵白素工作液,DAB顯色,中性樹脂封片。顯微鏡下觀察。

1.2.11 免疫印跡實驗檢測相關凋亡蛋白表達：制備蛋白,BCA(bicinchoninic acid)法蛋白定量。配制SDS-PAGE，在上層膠80 V、下層膠120 V下電泳45 min。在電壓100 V下轉膜90 min。取出硝酸纖維膜(NC膜)，用脫脂牛奶封閉1 h，以1∶300分別配制兔抗人的Bax/Bcl-2、Fas/Fas-L、LC-3和caspase3、8等，β-actin(1∶2 000)；4 ℃過夜；將NC條帶TBST洗滌；以1∶20 000配制二抗，將NC膜置于二抗液中，在室溫下孵育2 h； 增強化學發(fā)光法(ECL)顯色；圖像采集，β-actin為內參照，Image行灰度分析。以各條帶的吸光度值與其相應內參照的吸光度值的比值作統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1白頭翁皂苷D對于人惡性膠質細胞系U87MG的增殖影響

中等濃度時，白頭翁皂苷D對U87MG增殖抑制效果上升；高濃度梯度后，其抑制效果趨于平緩(圖1)。

2.2 凋亡形態(tài)學檢測

2.2.1 Hoechst33342染色：熒光顯微鏡下，處理組U87MG細胞系呈新月型和車輪狀改變，偶可見凋亡小體，呈典型凋亡形態(tài)表現(xiàn)，呈時間和濃度依賴。 陽

*Plt;0.05 compared with low concentration group圖1 白頭翁皂苷D對U87MG、EVC304和正常星形膠質細胞(NA)的增殖抑制Fig 1 The proliferation inhibition of the U87MG, EVC304 and NA by the Pulsatilla saponin D(n=6)

性對照組EVC304胞核形態(tài)未見異常(圖2A)。

2.2.2 透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構：處理組細胞微絨毛消失，胞質固縮、可見大量溶酶體，胞核濃聚、邊集，呈新月形或者車輪狀改變，核仁消失。對照組細胞形態(tài)完整，胞質豐富，細胞器未見明顯變化，核仁明顯。同時，處理組中觀測到呈雙膜結構、含有部分殘留細胞體的自噬體(圖2B)。

A.as the action time and concentration transformation, EVC304 was the positive control group, showed typical nuclear shape(×200); B.typical morphological change of apoptosis(×10 000) and the autophagy(×50 000)

圖2Hoechst33342染色、透射電鏡觀察白頭翁皂苷D誘導U87MG細胞改變
Fig2ThechangingandultrastructureofU87MGcellsunderthefluorescencemicroscopeandelectronmicroscope

A.the 12 hours group under the IC50 and IC75 with the TUNEL/PI staining (×200); B.the statistical analysis; *Plt;0.01 compared with control

2.2.3 TUNEL/PI染色檢測凋亡細胞：TUNEL處理后的凋亡細胞在激發(fā)光下顯綠色；PI染色后，膜破損的胞核在激發(fā)光下顯紅色；圖片疊加后采集(圖3)。參考Giudice計算細胞凋亡。

2.3 DNA-ladder檢測凋亡片段

處理組電泳條帶呈梯狀改變，IC50組凋亡片段集中在500～700 bp之間，IC75組集中在100～200 bp之間(圖4)。

2.4 AnnexinⅤ/PI法檢測凋亡

處理組凋亡比例隨濃度的提高而顯著高于對照組(Plt;0.01)(表1)。

早期凋亡和晚期凋亡占每樣本所檢測細胞總數(shù)隨著濃度的增加而增加，晚期凋亡在IC50時，其達到了(54.00±0.37)%(圖5A,B)。

2.5 細胞周期檢測

細胞凋亡的典型特征“亞G1峰”出現(xiàn)，并隨著濃度梯度的增加而升高；G0/G1期細胞所占比例相對增加，S期和G2/M期無明顯變化規(guī)律(圖5C，D)。

The result of the the apoptosis segments of U87MG cells disposed 12 hours by the Pulsatilla saponin D; M.DNA marker; C.control圖4 DNA電泳顯示凋亡片段Fig 4 DNA-ladder showed the apoptosis segments

2.6 細胞免疫組化檢測caspase-8表達

處理組胞質呈棕黃色，胞核為藍紫色，細胞形態(tài)皺縮；對照組中未見胞質深染，僅有胞核著色；U87MGcaspase-8陽性率表達隨著藥物作用濃度的升高而升高(圖6)。

表1 FITC-AnnexinⅤ/PI法檢測U87MG凋亡(%)Table 1 FITC-AnnexinⅤ/PI be used to detected the apoptosis of U87MG(n=3,s=0.01)

A.the apoptosis of U87MG cells; B.the cell cycle of U87MG cells, the green part was the SubG1 DNA content,C,D.the statistical analysis; *Plt;0.01 compared with control group

A.the expression of caspase-8 for the 12 hours group treated with IC50 and IC75(×200)；B.the statistical analysis;*Plt;0.01 compared with control group

2.7白頭翁皂苷D上調U87MG細胞caspase-8、caspase-3、Bax及Fas-L和下調Bcl-2的表達

Caspase-8、caspase-3、Bax、Fas-L蛋白表達量明顯上升，Bcl-2表達下調(圖7)

3 討論

近年來在體外研究時發(fā)現(xiàn)人參皂苷[3]、白藜蘆醇[4]、土貝母皂苷和紫杉醇等對腫瘤細胞有較強的致凋亡作用。惡性膠質瘤的現(xiàn)代診療手段雖取得進展，但效果并不理想[5]。白頭翁皂苷D對鼠源性LLC(Lewis 肺癌)細胞體外增殖有抑制作用[6]，對直腸癌細胞有促凋亡作用[7]。

本實驗首次研究白頭翁皂苷D對人腦惡性膠質瘤的作用。白頭翁皂苷D對U87MG有較強的生長抑制作用，呈濃度和時間依賴；隨白頭翁皂苷D濃度的遞增，U87MG增殖抑制明顯； EVC304、NA抑制率上升緩慢，且隨濃度變化起伏；故白頭翁皂苷D對于其細胞毒性作用較??；與其他化合單體[8]比較，白頭翁皂苷D在低濃度下就對U87MG有明顯的增殖抑制。

白頭翁皂苷D阻滯U87MG細胞周期。而細胞周期阻滯有可能導致細胞凋亡或者其他[9]。細胞周期的調控與細胞生長抑制、凋亡和腫瘤等都密切相關[10]。在U87MG中G0/G1期細胞數(shù)量隨著藥物濃度的增加而增加。Hoechest33342、透射電鏡、TUNEL/PI染色等發(fā)現(xiàn)白頭翁皂苷D對膠質瘤U87MG有促凋亡作用。

*Plt;0.05 compared with control圖7 白頭翁皂苷D處理U87MG后相關蛋白的表達Fig 7 The expression of Fas-L,Bcl-2,Bax,caspase-3,8 and β-actin(n=3)

白頭翁皂苷D對結腸癌腫瘤細胞的促凋亡作用是通過AKT/mTOR 信號通路[7]。細胞凋亡是一個復雜的信號傳導過程，其主要可以分為三條路徑，即依賴線粒體/細胞色素C介導的凋亡通路、死亡受體介導的凋亡通路和內質網(wǎng)通路。caspase家族在細胞凋亡中有舉足輕重的作用。通過免疫印跡實驗，caspase-3、8的表達水平隨著藥物作用濃度的增加而顯著增高。Bcl-2為抑制凋亡蛋白，當細胞DNA受到損傷后，黏附在線粒體上的Bcl-2可以阻止線粒體膜上通透轉換孔打開，從而抑制凋亡的級聯(lián)發(fā)生[11]。Bax可以下調Bcl-2的表達， Bax表達升高可以促進細胞凋亡。

在實驗樣本(U87MG)的超微結構中，可觀察到呈雙層膜結構、內含有部分胞質或細胞器的自噬體。自噬和凋亡關系復雜，有復雜的蛋白調控網(wǎng)絡，同時又和周期停滯有部分聯(lián)系[12]。

經(jīng)過初步研究發(fā)現(xiàn)白頭翁皂苷D對U87MG有明確的增殖抑制和促凋亡作用，該機制可能和FasL/Fas通路有關。U87MG細胞發(fā)生自噬的作用有待進一步證實。

[1] Cheng G, Zhang X, Tang HF,etal. Asterosaponin 1, a cytostatic compound from the starfish Culcita novaeguineae, functions by inducing apoptosis in human glioblastoma U87MG cells[J]. J Neurooncol, 2006, 79: 235-241.

[2] 陳仲廣, 李鵬,汪斌. 白頭翁湯治療潰瘍性腸炎的臨床應用及作用機制研究進展[J]. 世界中西醫(yī)結合雜志, 2013, 8: 94-96.

[3] 鄺姮，危建安，曾匯霞. 人參皂苷Rh2對人膀胱癌細胞T24增殖和凋亡的影響[J].中藥藥理與臨床, 2012, 28: 35-38.

[4] Detampel P, Beck M, Krahenbuhl S,etal. Drug interaction potential of resveratrol[J]. Drug Metab Rev, 2012, 44:253-265.

[5] Rahman M, Hoh B, Kohler N,etal. The future of glioma treatment: stem cells, nanotechnology and personalized medicine[J]. Future Oncol, 2012, 8:1149-1156.

[6] Kim Y, Bang SC, Lee JH,etal. Pulsatilla saponin D: the antitumor principle from Pulsatilla koreana[J]. Arch Pharm Res, 2004, 27:915-918.

[7] Son MK, Jung KH, Hong SW,etal. SB365, Pulsatilla saponin D suppresses the proliferation of human colon cancer cells and induces apoptosis by modulating the AKT/mTOR signalling pathway[J]. Food Chem,2013, 136:26-33.

[8] Tong QY, Qing Y, Shu D,etal. Deltonin, a steroidal saponin, inhibits colon cancer cell growthinvitroand tumor growthinvivovia induction of apoptosis and antiangiogenesis [J]. Cell Physiol Biochem, 2011, 27: 233-242.

[9] Schwartz GK. CDK inhibitors: cell cycle arrest versus apoptosis[J]. Cell Cycle, 2002, 1:122-123.

[10] Philipson L. Cell cycle exit: growth arrest, apoptosis, and tumor suppression revisited [J]. Mol Med, 1998, 4: 205-213.

[11] Reed JC. Mechanisms of apoptosis avoidance in cancer[J]. Curr Opin Oncol,1999, 11:68-75.

[12] Li CY, Wang EQ, Cheng Y,etal. Oridonin: An active diterpenoid targeting cell cycle arrest, apoptotic and autophagic pathways for cancer therapeutics [J]. Int J Biochem Cell Biol,2011, 43:701-704.

Pulsatilla saponin D induces cell apoptosis in the U87MG cells

LI Bo1, WANG Yuan-gang1, LI Juan1, TANG Hai-feng2, CHENG Guang1*

(1.Dept. of Neurosurgery, Neurosurgery Institnte of PLA;2.Dept. of Pharmacy, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

ObjectiveTo investigate the proliferation inbibition and apoptosis induction of the Pulsatilla saponin D on the human malignant glioma cell lines U87MGinvitro.MethodsThe proliferation-inhibiting effect and apoptosis of the U87MG cells treated with the different concentrations of the Pulsatilla Saponin D for different timesinvitrowere detected by MTT assay and the flow cytometry respectively. The cell apoptosis was examined by Hoshest 33342,the fluorescence fiber mirror,TUNEL/PI,DNA-ladder，and the apoptotic pathways were analysed by the Western blot analysis.ResultsThe proliferation inhibition of U87MG by Pulsatilla saponin D 14.016 nmol/mL was 94.034%(Plt;0.05). The nuclear shape of the U87MG cells was changed after treatment with Pulsatilla saponin D, and stained by Hoechst 33342 in a time-and-dose dependent manner. The total protein was extracted from the U87MG cells and the expression of the caspase-3,8,Bax and Fas-L were increased, while the level of Bax expression reduced. The level of Bcl-2 changed unobviously.ConclusionsPulsatilla saponin D can inhibit the proliferation of human malignant glioma cell lines U87MG with a time-dose dependent manner and induce the apoptosis of U87MG cells through the Fas/Fas-L pathway.

Pulsatilla saponin D; proliferation inhibition; apoptosis; cell cycle

2014-02-25

2014-03-13

國家自然科學基金(30873402)

*通信作者(correspondingauthor)：chg16801@163.com

1001-6325(2014)05-0654-07

R 739.41

A