帥 逸，于 洋，邵秉一，常鶴然，張立超，廖 立，金 巖*

(第四軍醫(yī)大學(xué) 1.口腔醫(yī)院 口腔組織病理科；2.組織工程研發(fā)中心，陜西 西安 710032; 3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 牙體牙髓病科， 重慶 400015； 4.佳木斯大學(xué) 附屬第二口腔醫(yī)院 口腔頜面外科， 黑龍江 佳木斯 154000)

研究論文

外源性BMMSCs通過改善內(nèi)源性BMMSCs成骨分化能力緩解去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松

帥 逸1,2，于 洋3，邵秉一3，常鶴然4，張立超4，廖 立1,2，金 巖1,2*

(第四軍醫(yī)大學(xué) 1.口腔醫(yī)院 口腔組織病理科；2.組織工程研發(fā)中心，陜西 西安 710032; 3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 牙體牙髓病科， 重慶 400015； 4.佳木斯大學(xué) 附屬第二口腔醫(yī)院 口腔頜面外科， 黑龍江 佳木斯 154000)

目的觀察系統(tǒng)注射骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSCs)是否通過改善內(nèi)源性BMMSCs成骨分化能力緩解去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松。方法12只雌性SD大鼠隨機分為假手術(shù)(sham)組、去卵巢(OVX)組、高劑量(high-dose)組和低劑量(low-dose)組。建立OVX和sham模型。術(shù)后24 h，高、低劑量組分別經(jīng)尾靜脈注射1.5×107和0.375×107cells/kg細胞。microCT掃描股骨近端。ALP和茜素紅染色檢測BMMSCs成骨能力，RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因。結(jié)果1)OVX組的骨密度(BMD)和骨小梁數(shù)量(Tb.N)低于sham組(Plt;0.05)，OVX組內(nèi)源性BMMSCs的成骨能力弱于sham組(Plt;0.05)。2)高劑量組的BMD和Tb.N高于OVX組(Plt;0.05)。高、低劑量組內(nèi)源性BMMSCs的成骨能力均強于OVX組(Plt;0.05)，高劑量組強于低劑量組(Plt;0.05)。結(jié)論系統(tǒng)注射BMMSCs通過改善OVX大鼠內(nèi)源性BMMSCs的成骨分化能力，緩解OVX大鼠骨質(zhì)疏松。

系統(tǒng)注射; 骨髓間充質(zhì)干細胞; 成骨分化; 骨質(zhì)疏松

《骨質(zhì)疏松中國白皮書》(2009)[1]顯示，2006年中國50歲以上人群中，約有5 600萬女性患有骨質(zhì)疏松，其中近50%有骨折史，嚴重影響生活質(zhì)量，因此絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的防治至關(guān)重要。系統(tǒng)注射間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)對疾病的療效已經(jīng)在多種疾病的研究中得到證實[2]。而利用骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)治療骨質(zhì)疏松的研究較少。本研究旨在明確外源性BMMSCs是否能通過改善內(nèi)源性BMMSCs成骨能力緩解OVX大鼠骨質(zhì)疏松，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雌性SD大鼠12只，體質(zhì)量140～150 g[第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，合格證號SCXK(軍)2007-007]，α-MEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和吲哚美辛(Sigma公司)，胰島素(萬邦制藥)，cell counting kit-8(CCK-8)試劑盒(Dojindo公司)，茜素紅(天津科密歐公司)，堿性磷酸酶活性試劑和甲苯胺藍(碧云天公司)，Trizol reagent(Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo公司)，大鼠β-actin、OCN、RUNX2和OPG引物(上海生工)。

1.2 方法

1.2.1 BMMSCs培養(yǎng)： 全骨髓貼壁培養(yǎng)法。以5×107細胞接種于75 cm2塑料培養(yǎng)瓶，含10%體積胎牛血清、1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)，CO2飽和度為5%。

1.2.2 BMMSCs增殖能力檢測： 克隆形成，以1×103細胞接種于75 cm2塑料培養(yǎng)皿，第10天行甲苯胺藍染色。增殖曲線，以1×103細胞/孔接種于96孔板。每孔加入10 μL CCK-8試劑，低速振蕩5 min，37 ℃避光孵育3 h，于450 nm處檢測吸光度值，0～7 d，每天同一時間點檢測。

1.2.3 BMMSCs成骨、成脂能力檢測： 以1×105細胞/孔接種于12孔板。成脂誘導(dǎo)7 d，油紅O染色，鏡下觀察脂滴形成情況。成骨誘導(dǎo)21 d，茜素紅染色，鏡下觀察鈣化結(jié)節(jié)形成情況。

1.2.4 模型建立、系統(tǒng)注射和取材： 建立OVX和sham模型。術(shù)后24 h，高、低劑量組分別經(jīng)尾靜脈注射1.5×107和0.375×107細胞/kg[3-6]的細胞懸液，sham和OVX組經(jīng)尾靜脈注射相同體積的PBS。10周后取右側(cè)股骨，4%多聚甲醛固定，左側(cè)股骨BMMSCs原代培養(yǎng)。

1.2.5 microCT掃描： 取右側(cè)股骨近端1 cm，連續(xù)掃描2 h，三維重建分析。

1.2.6 內(nèi)源性BMMSCs成骨能力的比較：成骨誘導(dǎo)方法同1.2.3。成骨誘導(dǎo)7 d，ALP染色，Image Pro Plus 6.0軟件分析感興趣區(qū)域的A值。成骨誘導(dǎo)21 d，茜素紅染色，10%十六烷基吡啶溶解，560 nm處檢測吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 注射用BMMSCs生物學(xué)特征鑒定

2.1.1 注射用BMMSCs增殖能力：培養(yǎng)皿中形成許多藍染克隆，克隆之間不相連，單個克隆中細胞生長密集(圖1A)。細胞1～4 d增殖較快， 5～7 d增殖較慢；第1天進入對數(shù)期，第5天進入平臺期(圖1B)。

2.1.2 注射用BMMSCs成骨、成脂能力：茜素紅染色，鏡下見大量紅色鈣化結(jié)節(jié)(圖1C)。油紅O染色，鏡下見細胞內(nèi)多個紅色圓形或橢圓形脂滴(圖1D)。

2.2 骨質(zhì)疏松模型建立成功

OVX組的BMD和Tb.N較sham組分別降低42%和50%(圖2，表1)。OVX組的ALP染色較sham組淺，A值降低80%(圖3A，表2)。OVX組的茜素紅染色較sham組淺，A值降低62%(圖3B，表2)。OVX組的OCN、RUNX2和OPG基因表達量較sham組分別降低61%、77%和60%(表3)。

2.3高劑量BMMSCs注射可緩解OVX大鼠骨質(zhì)疏松

高劑量組的BMD和Tb.N較OVX組分別升高44%和52%，低劑量組與OVX組區(qū)別不明顯(圖2，表1)。

2.4外源性BMMSCs可恢復(fù)OVX大鼠內(nèi)源性BMMSCs成骨分化能力

2.4.1 內(nèi)源性BMMSCs成骨誘導(dǎo)7 d ALP染色，21 d茜素紅染色：ALP染色，高、低劑量組染色較OVX組深，A值分別升高293%和96%，高劑量染色組比低劑量組深，A值升高98%(圖3A，表2)。茜素紅染色，高、低劑量組染色較OVX組深，A值分別升高114%和51%，高劑量組染色比低劑量組深，A值升高42%(圖3B，表2)。

表1 股骨近端BMD和Tb.N

*Plt;0.05 compared with sham;#Plt;0.05 compared with OVX;△Plt;0.05 compared with low-dose.

表2 內(nèi)源性BMMSCs的ALP和茜素紅染色定量

*Plt;0.05 compared with sham;#Plt;0.05 compared with OVX;△Plt;0.05 compared with low-dose.

A.clone formation(×40); B.proliferate curve;C.osteogenesis(×20); D.adipogenesis(×20)圖1 注射用BMMSCs生物學(xué)特征鑒定Fig 1 Biological characterization of injected BMMSCs

圖2 股骨近端顯微CT掃描Fig 2 microCT scanning of proximal femur

A.ALP staining; B.alizarin red staining圖3 內(nèi)源性BMMSCs的ALP和茜素紅染色Fig 3 ALP and alizarin red staining of endogenous BMMSCs

2.4.2 內(nèi)源性BMMSCs成骨誘導(dǎo)7 d成骨相關(guān)基因表達：高劑量組的OCN、RUNX2和OPG表達量較OVX組分別升高99%、231%和82%。低劑量組僅有RUNX2表達量較OVX組升高了75%(表3)。

3 討論

盡管臨床治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的藥物很多，但療效不佳且不良反應(yīng)多[7-8]。BMMSCs具有生物學(xué)和倫理學(xué)優(yōu)勢[9-10]，因此被廣泛應(yīng)用于多種疾病治療當中[2]。

表3 內(nèi)源性BMMSCs成骨相關(guān)基因的表達

*Plt;0.05 compared with sham;#Plt;0.05 compared with OVX;△Plt;0.05 compared with low-dose.

本實驗明確了分離的細胞具有干細胞的特征。發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)注射BMMSCs能夠有效減少OVX大鼠的骨量丟失，高劑量療效優(yōu)于低劑量。內(nèi)源性BMMSCs體外成骨分化能力的變化趨勢與顯微CT結(jié)果基本一致，說明OVX組內(nèi)源性BMMSCs的成骨分化能力受損，外源性BMMSCs可能是通過改善內(nèi)源性BMMSCs的成骨分化能力緩解骨質(zhì)疏松的。雖然低劑量組內(nèi)源性BMMSCs的成骨分化能力強于OVX組，但僅有RUNX2的表達量高于OVX組，且兩組的BMD和Tb.N無明顯差異，這提示低劑量外源性BMMSCs對OVX大鼠內(nèi)源性BMMSCs成骨分化能力的改善程度有限，還不能達到提高骨量的作用雌激素缺乏時，機體穩(wěn)態(tài)遭到破壞，以致內(nèi)源性BMMSCs成骨分化能力異常，從而影響成骨-破骨平衡[11-12]。目前臨床常用藥物大多是抑制破骨過程，而促進成骨的藥物較少。本實驗的創(chuàng)新點在于發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)注射BMMSCs可以通過恢復(fù)OVX大鼠內(nèi)源性BMMSCs的成骨分化能力，緩解雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松。相對于低劑量BMMSCs，高劑量BMMSCs進入體內(nèi)后，可能在分泌因子的量和與內(nèi)源性細胞接觸范圍上占有優(yōu)勢，從而形成更為有利的微環(huán)境，間接影響到成骨-破骨平衡，更好地發(fā)揮療效。

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Exogenous BMMSCs ameliorate osteoporosis ofovariectomized rat via improving osteogenesis of endogenous BMMSCs

SHUAI Yi1,2, YU Yang3, SHAO Bing-yi3, CHANG He-ran4, ZHANG Li-chao4, LIAO Li1,2, JIN Yan1,2*

(1.Dept. of Oral Histology and Pathology, School of Stomatology; 2.Tissue Engineering Ramp;D Center, the Fourth Military Medical University,Xi’an 710032; 3.Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015; 4.Dept. of Oral andMaxillofacial Surgery, the Second Affiliated Hospital of Stomatology, Jiamusi University, Jiamusi 154000, China)

ObjectiveTo find whether systemic administration of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) can prevent osteoporosis of ovariectomized rat via ameliorating osteogenesis of endogenous BMMSCs.MethodsTwelve female Sprague-Dawley rats were randomly divided into group sham, OVX, high-dose and low-dose. Established OVX and sham model. 24 hours after operation, rats in group high-dose and low-dose were systemically injected BMMSCs via tail vein at the dose of 1.5×107and 0.375×107cells/kg, respectively. Proximal femurs were analysed by MicroCT. Osteogenesis of BMMSCs was examined by ALP, alizarin red staining and real-time PCR.ResultsBone mineral density (BMD) and trabecular bone number (Tb.N) of group OVX were lower than those from group sham. BMD and Tb.N of group high-dose were higer than group OVX. Compared to group OVX,osteogenesis of endogenous BMMSCs derived from high-dose group and low-dose group were much better, and that from high-dose group turned out to be better than low-dose group.ConclusionsIt is effective to relieve symptoms of osteoporosis in ovariectomized rats through treating them with exogenous BMMSCs by the way of rescuing osteogenesis of endogenous BMMSCs.

systemic injection; bone marrow mesenchymal stem cells; osteogenesis; osteoporosis

2013-10-31

2014-01-13

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973)(2011CB964700)

*通信作者(correspondingauthor)： yanjinfmmu@139.com

1001-6325(2014)05-0610-05

R322.7+1

A