姚曉敏，李 越，張小莉，李本勇，林愛斌，李宏偉

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，浙江 寧波315100；2.北京市理化分析測(cè)試中心，北京100050；3.吉林省四平市中心醫(yī)院小兒外科，吉林 四平136000）

目前已知數(shù)以千計(jì)的藥物可引起肝毒性[1]，其表現(xiàn)與人類各種肝病的表現(xiàn)相同， 可以表現(xiàn)為肝細(xì)胞壞死、膽汁瘀積、細(xì)胞內(nèi)微脂滴沉積或慢性肝炎、肝硬化等。 其中，四環(huán)素是引起肝毒性的藥物之一，可誘發(fā)小泡性脂肪肝。 臨床上根據(jù)患者是否飲酒將脂肪肝分為酒精性脂肪肝 （ALD） 和非酒精性脂肪肝（NAFLD），NAFLD 是無過量飲酒史（男性＜140 g 乙醇/周，女性＜70 g 乙醇/周）、肝組織學(xué)病變與ALD 相似的臨床綜合征，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和脂肪肝性肝硬化。 據(jù)報(bào)道，該病的患病率正在迅速上升， 已成為世界性公共衛(wèi)生問題之一[2]。 對(duì)于脂肪肝的治療，尚無療效確切的藥物，尋找有效的藥物治療NAFLD 十分必要。中藥有著多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)綜合作用的特點(diǎn)，在治療脂肪肝方面有著自身的優(yōu)勢(shì)。 因此，本研究采用四環(huán)素建立小鼠肝毒性模型， 考察中藥黃芪主要有效組分多糖和總黃酮對(duì)NAFLD 的保護(hù)作用， 并比較二者對(duì)NAFLD 的保護(hù)作用，為黃芪的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

ICR 小鼠50 只， 雄性， 體質(zhì)量20～22 g，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，動(dòng)物許可證編號(hào)No.SCXK（京）2012-0001。 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)于北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，即屏蔽級(jí)動(dòng)物房，每日明暗室各12 h，恒溫恒濕，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。

1.2 藥物與試劑

鹽酸四環(huán)素（CAS：64-75-5）購(gòu)自Ameresco 公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）（貨號(hào)C009-2）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）（貨號(hào)C010-2）、甘油三酯（TG）（貨號(hào)F001-1）、膽固醇（CHO）（貨號(hào)F002-2）、丙二醛（MDA）（貨號(hào)A003-1）、超氧化物歧化酶（SOD）（貨號(hào)A001-1）和谷胱甘肽（GSH）（貨號(hào)A006-2）測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；黃芪多糖和黃芪總黃酮均購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司， 純度大于90%；聯(lián)苯雙酯滴丸（批號(hào)：13010104）購(gòu)自北京市地壇醫(yī)院；其他試劑均為分析純化學(xué)試劑。

1.3 主要儀器

IKA T10 勻漿機(jī)（basic）；GD120-S12 加熱制冷水 浴 槽（Grant）；多 功 能 酶 標(biāo) 儀（varianscan Flash，Thermo）；電子天平（LA5002，上海精天電子儀器公司）；PHS-3C 酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器廠）；80i 電子顯微鏡（Nikon）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組 將ICR 小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只，分別為正常對(duì)照組、四環(huán)素模型組、黃芪多糖組、黃芪總黃酮組和聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性對(duì)照組。

1.4.2 給藥方法 黃芪多糖、總黃酮和聯(lián)苯雙酯分別采用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配成濃度分別為62.5、62.5、18.75 mg/mL 的溶液，給藥組分別按體質(zhì)量給予黃芪多糖（500 mg/kg）、黃芪總黃酮（500 mg/kg）和聯(lián)苯雙酯（150 mg/kg），連續(xù)灌胃10 d， 正常組和模型組給予同體積0.5% CMC-Na溶液。

1.4.3 造模方法[3]在第10 天給藥后1 h 時(shí)腹腔注射四環(huán)素200 mg/kg， 對(duì)照組給予等體積生理鹽水。 給毒后24 h 眼球取血，并取肝臟進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4 檢測(cè)指標(biāo) 利用試劑盒，采用比色法測(cè)定小鼠血清ALT、AST、TG 和CHO 水平， 以及 肝組織TG、CHO、MDA、SOD 和GSH 水平；取肝組織經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定后做病理切片。 酒精梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度約5 μm），經(jīng)蘇木素-伊紅（HE）染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理分析數(shù)據(jù)， 采用Student-Newman-Keuls（SNK）檢驗(yàn)對(duì)各組同一時(shí)間點(diǎn)的同一指標(biāo)進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“±s”表示，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖與總黃酮對(duì)四環(huán)素所致小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶和血脂異常的影響

本研究給予小鼠腹腔注射四環(huán)素24 h 后血清ALT 和AST 顯著升高（P＜0.01），分別為正常對(duì)照組的4.4 和1.5 倍。 黃芪多糖和黃芪總黃酮預(yù)防性治療均能夠顯著抑制ALT 水平的升高（P＜0.01），但是對(duì)于AST 水平的變化，只有黃芪多糖能抑制其升高（P＜0.01）。

此外， 本實(shí)驗(yàn)給予小鼠腹腔注射四環(huán)素24 h后， 還可見血清TG 和CHO 出現(xiàn)顯著下降 （P＜0.01），分別下降為對(duì)照組的39.5%和53.1%。而給予黃芪多糖預(yù)防性干預(yù)能明顯抑制小鼠血脂異常降低（P＜0.01，P＜0.05），但是黃芪總黃酮預(yù)防性治療對(duì)其血脂的變化無顯著影響。 見表1。

表1 黃芪對(duì)四環(huán)素所致小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶和血脂改變的影響 （n=10，±s）

表1 黃芪對(duì)四環(huán)素所致小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶和血脂改變的影響 （n=10，±s）

注： 與正常對(duì)照組比較**P＜0.01，***P＜0.001； 與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。 下表同。

組 別正常對(duì)照組模型組黃芪多糖組黃芪總黃酮組聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性對(duì)照組劑量（mg/kg）— —500 500 150 ALT（U/L）10.89±3.38 48.08±8.91***18.59±5.70###22.71±8.69###14.22±4.06###AST（U/L）24.72±8.02 37.78±5.71**26.90±3.86##38.10±9.88 31.72±9.70 TG（mg/dl）105.32±13.35 41.59±9.49***71.92±20.17##34.79±10.35 92.51±28.19##CHO（mg/dl）198.26±33.46 105.33±25.82***144.71±21.77#132.31±30.23 117.93±16.26

2.2 黃芪多糖與總黃酮對(duì)四環(huán)素所致小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積的作用

給予小鼠腹腔注射四環(huán)素24 h 后， 肝臟出現(xiàn)明顯的TG 和CHO 蓄積（P＜0.01），分別為對(duì)照組的2.4 和1.3 倍。黃芪多糖和總黃酮均只能顯著減輕四環(huán)素引起的小鼠肝臟CHO 蓄積（P＜0.01）。 見表2。

表2 黃芪對(duì)四環(huán)素所致小鼠肝脂改變的影響（n=10，±s）

表2 黃芪對(duì)四環(huán)素所致小鼠肝脂改變的影響（n=10，±s）

組 別正常對(duì)照組模型組黃芪多糖組黃芪總黃酮組聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性對(duì)照組劑量（mg/kg）— —500 500 150 TG（mmol/g）105.81±16.40 253.02±53.64***221.64±15.50 218.92±34.92 171.36±39.90#CHO（mmol/g）32.89±3.44 42.99±6.55**9.58±4.81##14.43±2.94###21.95±4.16###

2.3 黃芪多糖與總黃酮對(duì)四環(huán)素所致小鼠肝臟氧化損傷的作用

模型組腹腔注射四環(huán)素24 h 時(shí)肝勻漿MDA水平顯著升高為正常組的3.5 倍（P＜0.01）。 而黃芪多糖和總黃酮組對(duì)MDA 升高有抑制趨勢(shì)， 但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 模型組小鼠肝臟抗氧化酶SOD活性升高了10.8%，GSH 顯著升高了73.1%，黃芪總黃酮（500 mg/kg）可進(jìn)一步顯著升高GSH 水平（P＜0.05），對(duì)抗氧化物SOD 活性影響不明顯。 而黃芪多糖只是有升高SOD 活性和GSH 水平趨勢(shì)， 但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表3。

表3 黃芪對(duì)四環(huán)素所致小鼠肝組織MDA 形成和抗氧化物水平改變的影響 （n=10，±s）

表3 黃芪對(duì)四環(huán)素所致小鼠肝組織MDA 形成和抗氧化物水平改變的影響 （n=10，±s）

組 別正常對(duì)照組模型組黃芪多糖組黃芪總黃酮組聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性對(duì)照組劑量（mg/kg）— —500 500 150 MDA（nmol/mg）0.60±0.15 2.10±0.53***1.84±0.59 1.59±0.29 1.32±0.57#SOD（U/mg）89.01±15.05 98.65±5.75 98.92±6.41 96.83±5.19 82.87±4.41###GSH（mg/g）0.93±0.13 1.61±0.68*1.47±0.44 2.39±0.32#2.84±0.80#

2.4 黃芪多糖與總黃酮對(duì)四環(huán)素所致小鼠肝臟病理組織學(xué)改變的作用

ICR 小鼠腹腔注射四環(huán)素后24 h 取肝臟，經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，HE 染色。光鏡下可見正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉、中央靜脈、匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊；模型組動(dòng)物肝臟的中央靜脈和小葉間靜脈周圍出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、水樣變性、小泡性脂變等；黃芪多糖和總黃酮（500 mg/kg）可明顯減輕上述肝組織損傷、壞死和小泡性脂變程度，如圖1 所示，見封三彩圖。

3 討論

黃芪的主要化學(xué)成分是多糖、黃酮及皂苷。 藥用歷史悠久，應(yīng)用廣泛。 黃芪在肝臟疾病的治療中顯現(xiàn)出很好的療效。 如在乙肝、肝損傷、脂肪肝和肝纖維化治療方面，黃芪注射液及黃芪復(fù)方湯藥都顯示出療效明顯的保肝作用[4-8]。 但是，黃芪注射液對(duì)脂肪肝的改善作用的有效組分，以及對(duì)藥物所致脂肪肝的作用和作用機(jī)制等尚不清。

本研究首先建立四環(huán)素誘導(dǎo)脂肪肝模型，即腹腔注射單劑量四環(huán)素（200 mg/kg）能夠引起小鼠肝臟脂肪變性，表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶ALT 和AST 明顯升高、 血脂TG 和CHO 顯著降低、 肝臟脂質(zhì)TG 和CHO 聚積，以及肝細(xì)胞出現(xiàn)小泡性脂質(zhì)聚集和水樣變性，上述結(jié)果均可反映出腹腔注射四環(huán)素引起小鼠發(fā)生脂肪肝的早期變化。 以往研究表明，過量四環(huán)素造成急性肝細(xì)胞脂肪變的原因之一是：抑制微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白（MTP）活力，阻斷極低密度脂蛋白（VLDL）組裝，導(dǎo)致脂質(zhì)不能以脂蛋白的形式運(yùn)送出肝臟，引起TG 和CHO 分泌減少[9-10]，從而使血清TG 和CHO 下降， 而肝組織TG 和CHO 增多。而黃芪多糖可明顯降低升高的血清ALT 和AST 水平，抑制血清TG 和CHO 水平的下降，并降低肝臟脂質(zhì)CHO 的聚集。 而黃芪總黃酮只抑制血清ALT和肝組織CHO 水平的異常升高， 對(duì)血清AST、TG、CHO 以及肝組織TG 無明顯作用。此外，黃芪多糖和總黃酮均可明顯改善四環(huán)素所致肝細(xì)胞腫脹、水樣變性和小泡性脂變等病理學(xué)改變。 從而提示，黃芪的這兩個(gè)組分均可明顯改善四環(huán)素所致小鼠肝組織脂肪變的發(fā)生，但是，黃芪總黃酮對(duì)四環(huán)素所致小鼠肝組織脂肪變性的作用明顯弱于多糖的作用。此結(jié)果與以往報(bào)道黃芪多糖的作用基本一致[11]，說明黃芪抗脂肪肝作用的最主要有效組分可能是多糖，其次是黃酮。

對(duì)于NAFLD 的發(fā)病機(jī)制，目前以Day[12]提出的“二次打擊學(xué)說”最為著名。 第一次打擊為各種原因?qū)е碌囊葝u素抵抗，游離脂肪酸（FFA）增加，肝臟脂肪代謝障礙， 從而使肝細(xì)胞內(nèi)合成TG 增加而輸出減少，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性。 第二次打擊是在第一次的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，線粒體功能失調(diào)，呼吸鏈復(fù)合物活性降低等。 四環(huán)素是引起肝細(xì)胞脂肪變性的藥物之一，可誘發(fā)小泡性脂肪肝。過量ROS 生成或抗氧化物的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷[13]。丙二醛（MDA）是肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，其含量可以反映脂質(zhì)過氧化程度。 而SOD 和GSH是體內(nèi)防御氧化損傷的重要抗氧化物。 本研究結(jié)果顯示，小鼠腹腔注射四環(huán)素后肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 明顯增多， 抗氧化物GSH 含量出現(xiàn)升高，可考慮為抗氧化物的升高屬于代償性，以利于自由基清除。 而黃芪多糖和總黃酮預(yù)防給藥雖然沒有顯著地抑制MDA 增多， 但是二者預(yù)防給藥均有明顯升高GSH 和SOD 水平的趨勢(shì)， 尤其是總黃酮可進(jìn)一步顯著升高肝組織GSH 水平。 由此推測(cè)，黃芪多糖和總黃酮抗四環(huán)素所致小鼠肝細(xì)胞脂肪變性的機(jī)制可能與其抗氧化作用相關(guān)。

綜上所述，單劑量腹腔注射四環(huán)素可引起小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的脂肪變性，其發(fā)生機(jī)制與氧化應(yīng)激有關(guān)。 黃芪多糖和總黃酮預(yù)防給藥對(duì)四環(huán)素引起肝細(xì)胞脂肪變性均顯示出不同程度的保護(hù)作用，黃芪多糖作用明顯強(qiáng)于總黃酮，與其抗氧化作用密切相關(guān)，其作用的最主要有效組分是多糖，其次是總黃酮。 此研究將為NAFLD 的臨床治療，以及進(jìn)一步開發(fā)黃芪有效組分為保肝降脂藥的應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

致謝：本實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物飼養(yǎng)于北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，感謝北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心對(duì)本實(shí)驗(yàn)的完成所提供的所有幫助！

[1]劉 蕾，張曉嵐.藥物性肝損傷診斷與防治進(jìn)展[J].臨床肝膽病雜志，2012，28(6)：477-479.

[2]Kelishadi R，Poursafa P. Obesity and air pollution：global risk factors for pediatric non-alcoholic fatty liver disease [J]. Hepat Mon，2011，11(10)：794-802.

[3]Yu HY，Wang BL，Zhao J，et al. Protective effect of bicyclol on tetracycline-induced fatty liver in mice [J]. Toxicology，2009，261(1)：112-118.

[4]吳士杰.黃苠柴胡湯治療慢性乙型肝炎80 例[J].陜西中醫(yī)，2004，25(1)：36-36.

[5]王要軍，權(quán)啟鎮(zhèn)，孫百勤，等.黃芪對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化組織ICAM-l表達(dá)影響的免疫化研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)雜志，2000，5(1)：49-49.

[6]程 鵬，劉素俠，孫晉浩，等.黃芪抗肝纖維化的作用與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βl 及干擾素γ 的關(guān)系[J].臨床軍醫(yī)雜志，2000，28(3)：22-22.

[7]阮明鳳，郝君梅.黃芪對(duì)大鼠酒精性肝病肝組織ICAM-1 表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(5)：1 119-1 120.

[8]何衛(wèi)美，宋育林，方 芳，等.黃芪提取物對(duì)大鼠非酒精性脂肪性肝病SREBP-1 表達(dá)的影響[J].安徽醫(yī)藥，2010，14(3)：273-274.

[9]Letteron P，Sutton A，Mansouri A，et al. Inhibition of microsomal triglyceride transfer protein：another mechanism for drug-induced steatosis in mice [J]. Hepatology，2003，38(1)：133-140.

[10]Breen K，Schenker S，Heimberg M. The effect of tetracycline on the hepatic secretion of triglyceride [J]. Biochim Biophys Acta，1972，270(1)：74-80.

[11]孫善坤.靜脈滴注黃芪治療酒精性脂肪肝150 例臨床觀察[J].山西醫(yī)藥雜志，2002，31(6)：459-459.

[12]Day CP. Pathogenesis of steatohepatitis [J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol，2002，16(5)：663-678.

[13]Harrison SA，Kadakia S，Lang KA，et al. Nonalcoholic steatohepatitis：what we know in the new millennium [J]. Am J Gastroenterol，2002，97(11)：2 714-2 724.