楊永霞，魏躍偉，馮琦，王霄龍，王晶，趙宸楠，崔紅

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號(hào)，450002

農(nóng)藝與調(diào)制

典型生態(tài)區(qū)煙葉腺毛發(fā)育及其分泌物比較研究

楊永霞，魏躍偉，馮琦，王霄龍，王晶，趙宸楠，崔紅

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號(hào)，450002

以煙草品種K326為材料，分別種植在河南平頂山、貴州遵義和云南江川三個(gè)典型生態(tài)區(qū)，在煙草葉片發(fā)育過(guò)程中對(duì)葉面腺毛形態(tài)、密度、腺毛分泌物及基因表達(dá)水平進(jìn)行了比較研究。顯微觀察發(fā)現(xiàn)腺毛類型在3個(gè)地區(qū)間變化不大，都以長(zhǎng)柄多腺頭腺毛為主，但腺毛密度以貴州遵義產(chǎn)區(qū)的煙葉最高，河南次之，云南最低；GC/MS檢測(cè)表明，西柏三烯二醇含量以河南產(chǎn)區(qū)為最高，且河南和云南產(chǎn)區(qū)隨葉齡變化趨勢(shì)相同；RT-PCR分析表明，西柏烷類化合物合成關(guān)鍵酶基因CYC-1和CYP71D16轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平與西柏三烯二醇含量的變化趨勢(shì)一致。該研究表明生態(tài)環(huán)境對(duì)煙草腺毛發(fā)育和物質(zhì)代謝具有較大影響，葉面分泌物與煙葉風(fēng)格特色密切相關(guān)。

煙草；腺毛；密度；分泌物；基因表達(dá)

煙草葉面腺毛濃密，則分泌旺盛。烤煙腺毛分泌物的主要成分為西柏烷類化合物，對(duì)煙草品種T.I 1068的葉面化學(xué)成分的分析表明，西柏三烯二醇含量占葉面總化學(xué)成分含量的60% 左右[1]。在葉片調(diào)制過(guò)程中，西柏烷類化合物降解產(chǎn)生茄酮、茄醇和降茄二酮等多種成分，與煙草香氣密切相關(guān)[2]。煙草腺毛的生長(zhǎng)發(fā)育及物質(zhì)代謝和分泌受多種環(huán)境因子和栽培措施的影響，不同品種在不同肥料[3]、水分[4]以及光照[5]等條件下，腺毛的密度、類型以及分泌能力不同，而葉面化學(xué)成分的差異也是影響煙葉的香氣品質(zhì)和風(fēng)格的主要因素之一[6-8]。我國(guó)地域遼闊，生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，形成了以濃香型、清香型和中間香型為代表的烤煙類型[9]。濃香型烤煙以河南煙葉為代表，煙氣濃郁，勁頭適中，有雜氣和刺激性；清香型烤煙以云南煙葉為代表，煙氣清香淡雅、吸味舒適、煙味較淡、雜氣輕微；中間香型烤煙以貴州煙葉為代表，煙氣風(fēng)格細(xì)膩柔和、雜氣輕、刺激輕微、余味干凈。目前，關(guān)于特色煙葉風(fēng)格的形成機(jī)理方面的研究多集中在葉片發(fā)育、物質(zhì)代謝規(guī)律等方面，而有關(guān)葉面腺毛的研究尚少有報(bào)道。為此，在河南平頂山、云南江川、貴州遵義煙區(qū)采用顯微觀察、GC/MS技術(shù)及RT-PCR技術(shù)，對(duì)栽培煙草K326葉片發(fā)育過(guò)程中葉面腺毛形態(tài)結(jié)構(gòu)、分泌物含量及分泌物合成相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，旨在明確不同生態(tài)煙區(qū)葉片腺毛發(fā)育和物質(zhì)分泌的特點(diǎn)及其對(duì)煙葉特色風(fēng)格的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種K326，分別種植在河南平頂山、貴州遵義和云南江川3個(gè)典型生態(tài)區(qū)，栽培管理按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙栽培技術(shù)規(guī)范實(shí)施。3個(gè)生態(tài)區(qū)均在煙株第12片（從下至上數(shù)）有效葉葉齡分別為10 d，20 d，30 d，40 d和50 d時(shí)取樣(從葉片發(fā)生2 cm時(shí)即為葉齡第1天)，樣品用于腺毛電鏡掃描觀察、葉面分泌物的提取測(cè)定及基因表達(dá)分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉面腺毛密度統(tǒng)計(jì)

選取從葉尖向葉基數(shù)第6～8支脈間，主脈至右側(cè)葉緣之間的中央位置，取1 mm×2 mm大小的葉片組織，同時(shí)取多片作為重復(fù)樣，將其迅速轉(zhuǎn)移至4%戊二醛固定液（pH7.2）中固定，經(jīng)過(guò)一系列乙醇脫水后，固定噴金，并使用Quanta 200掃描電鏡（美國(guó)FEI公司）觀察拍照，采用氣體二次電子成像；工作電壓15～20 kV，工作距離14.5～20 mm。腺毛密度統(tǒng)計(jì)時(shí)選取5個(gè)視野作為重復(fù)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 葉面分泌物的提取檢測(cè)

采用韓錦峰等[10]的方法分別在葉基部和葉中部于主脈兩側(cè)對(duì)稱位置及葉尖沿主脈位置切取直徑為10 cm的圓片共15片（幼葉取樣時(shí)圓片直徑為5 cm，圓片數(shù)增加到60片），并依次將圓片在1000 mL二氯甲烷中浸提，每次浸提2 s，重復(fù)3次，加入含正十七烷醇內(nèi)標(biāo)1 mL，得到的浸提液經(jīng)過(guò)濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、氮吹儀吹干、硅烷化處理后，采用氣質(zhì)聯(lián)用分析儀（色譜儀型號(hào)HP-5890，質(zhì)譜儀型號(hào)vc-70SE）分離、分析，并通過(guò)檢索譜庫(kù)（NIST08）確定成分。分析條件：

色譜柱為DB-5MSUI石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度為250℃；程序升溫：；載氣為高純氦氣，載氣流速為恒流0.8 mL/min；進(jìn)樣量為1.0 μL，分流比為15:1。傳輸線溫度250℃；EI離子源溫度280 ℃；電離能量70 eV；質(zhì)量數(shù)范圍50～650 amu。

根據(jù)圓片直徑計(jì)算得出圓片總面積，使用Office Excel 2003進(jìn)行結(jié)果的匯總，整理及圖表處理。

1.2.3 葉面分泌相關(guān)基因表達(dá)分析

取3片來(lái)自不同煙株的中部葉，迅速放入液氮冷卻，樣品按照Invitrogen Trizol Reagent說(shuō)明書提供方法提取煙草總RNA，樣品通過(guò)隨機(jī)引物法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物設(shè)計(jì)使用Premier Primer 5.0軟件，根據(jù)Genbank發(fā)布的CYC-1，CYP71D16和L25（其中L25是煙草核糖體蛋白[11]，本研究中作為內(nèi)參基因）序列設(shè)計(jì)各基因擴(kuò)增引物。

表1 擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer sequence for amplification

PCR反應(yīng)體系為20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用1.5 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，并觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉表面腺毛密度統(tǒng)計(jì)

利用顯微技術(shù)對(duì)葉片發(fā)育過(guò)程中葉面腺毛的觀察發(fā)現(xiàn)，3個(gè)地區(qū)腺毛類型均以長(zhǎng)柄多腺頭腺毛為主(圖1)。腺毛密度隨葉片發(fā)育呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，如圖2所示。在3個(gè)生態(tài)區(qū)，葉齡10 d時(shí)（圖1）腺毛密度皆達(dá)到最高，隨后急劇下降，這可能是由于葉片進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，葉面積迅速擴(kuò)展而引起。從葉齡20 d到40 d腺毛密度呈平緩下降的趨勢(shì)。在葉齡50 d時(shí)密度又有明顯的下降，這可能是由于煙葉進(jìn)入成熟階段，大量腺毛脫落所致，這與時(shí)向東[12]等的報(bào)道一致；但云南地區(qū)煙葉腺毛密度在葉齡50 d時(shí)有所回升，此現(xiàn)象李鵬飛[13]等也曾有報(bào)道，其原因尚不明確。三個(gè)生態(tài)區(qū)相比較，相同葉齡貴州產(chǎn)區(qū)的煙葉腺毛密度最高，河南次之，云南最低。

圖1 葉齡10 d時(shí)葉片腺毛顯微觀察圖Fig.1 micrograph of tobacco leaf trichome at 10 days leaf age

圖2 不同葉齡煙葉腺毛密度的變化Fig.2 Densities of tobacco leaf trichome at different leaf ages

2.2 煙葉腺毛分泌物的檢測(cè)

采用葉圓片法提取葉面化學(xué)物質(zhì)，利用GC/MS共檢測(cè)出47種物質(zhì)，其中未知成分12種，已知成分35種。葉面化學(xué)物質(zhì)中西柏烷類化合物是腺毛分泌物的主要成分，試驗(yàn)檢測(cè)出的西柏烷類化合物包括α-西柏三烯一醇、β-西柏三烯一醇、α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇、以及四種西柏三烯二醇的同分異構(gòu)體。此外還檢測(cè)到多種烷烴和糖脂類物質(zhì)，但是含量相對(duì)較低（見圖3）。

圖3 葉面化學(xué)各成分色譜分析圖Fig.3 Chromatogram of chemical components on tobacco leaf surface

圖4顯示了三個(gè)生態(tài)區(qū)葉片腺毛主要分泌物西柏三烯二醇總量的積累變化規(guī)律?？梢钥闯?，隨著葉片的發(fā)育，西柏三烯二醇含量呈現(xiàn)規(guī)律性變化，而云南和河南產(chǎn)區(qū)變化趨勢(shì)趨于一致：在葉齡10d時(shí)西柏三烯二醇有較高水平的積累，隨后降低，在葉齡30d達(dá)到最小值，隨后逐漸上升，并在采收前下降。在貴州產(chǎn)區(qū)則有所不同，在葉齡20d時(shí)西柏三烯二醇積累水平較高，隨后在葉齡40d時(shí)降至最低，之后緩慢上升。三地區(qū)間相比，河南產(chǎn)區(qū)煙葉中西柏三烯二醇含量較高，貴州其次，而云南含量相對(duì)較低。

圖4 三個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉腺毛分泌物西柏三烯二醇的含量比較Fig.4 Comparison of trichome excretion cembratriene-diol between different growing areas

2.3 西柏烷化合物合成相關(guān)基因表達(dá)分析

西柏三烯一醇合成酶（cembratriene-ol synthase，CYC-1）是將牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸轉(zhuǎn)化為西柏三烯一醇的關(guān)鍵酶[14]；西柏三烯一醇羥化酶（cembratriene-ol hydroxylase，CYP71D16），則 催化西柏三烯一醇向西柏三烯二醇的轉(zhuǎn)化[15]，二者都是西柏烷類化合物合成的關(guān)鍵酶，與腺毛的物質(zhì)代謝和分泌密切相關(guān)。以L25基因?yàn)閮?nèi)參，對(duì)葉片發(fā)育過(guò)程中這兩個(gè)酶所對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果如圖5所示，從圖中可以看出，隨著葉片發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，西柏烷類化合物合成相關(guān)基因的表達(dá)強(qiáng)度在云南和河南都是葉齡10d表達(dá)最強(qiáng)，之后減弱，河南地區(qū)在葉齡30d時(shí)又有所增強(qiáng)，在貴州則是葉齡20d表達(dá)最強(qiáng)，之后減弱，40d表達(dá)又有所增強(qiáng)。這與西柏三烯二醇含量的變化趨勢(shì)一致。三個(gè)產(chǎn)區(qū)相比，河南、貴州煙葉腺毛分泌物合成相關(guān)基因的表達(dá)相對(duì)較強(qiáng)，云南最低。而在同一產(chǎn)區(qū)，所測(cè)定的兩基因表達(dá)規(guī)律趨于一致，具有一定協(xié)同性。

圖5 不同葉齡腺毛類萜代謝關(guān)鍵基因半定量表達(dá)分析Fig.5 semi-quantitative expression of key gene of trichome terpenoid metabolism in different age tobacco leaves

3 結(jié)論與討論

煙草品種K326在三個(gè)生態(tài)區(qū)間葉片腺毛類型均以長(zhǎng)柄多腺頭腺毛為主，葉片腺毛密度和腺毛分泌物變化趨勢(shì)相同。腺毛密度在葉齡10到20 d間急劇下降，之后逐漸保持平穩(wěn)；煙葉腺毛分泌物含量隨葉片的發(fā)育由高到低，緩慢上升并迅速下降，二者之間關(guān)系密切。葉片發(fā)育早期腺毛密度高，是導(dǎo)致腺毛分泌物含量較高的主要原因；隨著葉片的迅速擴(kuò)展，腺毛密度下降，分泌物含量也迅速降低；葉片發(fā)育后期，腺毛密度穩(wěn)定，腺毛的結(jié)構(gòu)發(fā)育成熟和代謝活躍是引起分泌物含量上升的主要原因；隨著葉片的成熟，腺毛脫落，分泌物的合成代謝減弱，分泌物含量又開始下降。這與楊鐵釗等[16]、Court等[17]的研究結(jié)果一致。對(duì)西柏烷類化合物合成關(guān)鍵基因CYC-1和CYP71D16的表達(dá)分析來(lái)看，隨葉片發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，基因表達(dá)呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，這與西柏三烯二醇的含量變化趨勢(shì)一致。

三個(gè)生態(tài)區(qū)中貴州產(chǎn)區(qū)不同葉齡葉片腺毛密度均明顯高于河南和云南產(chǎn)區(qū)，這可能與貴州煙區(qū)葉片發(fā)育遲緩、葉面積相對(duì)較小有關(guān)。雖然K326品種在貴州產(chǎn)區(qū)的煙葉腺毛密度最高，但化學(xué)分析結(jié)果顯示河南煙葉中腺毛分泌物西柏三烯二醇的含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這與李章海等[18]的研究結(jié)果一致。他們的結(jié)果表明腺毛分泌物的主要降解產(chǎn)物——茄酮的含量在3個(gè)產(chǎn)區(qū)烤后煙樣中以河南為最高，與其它兩地區(qū)的差異達(dá)到極顯著水平，并由此推測(cè)茄酮對(duì)濃香型煙葉特色風(fēng)格具有重大影響，是主要的代表性物質(zhì)成分之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了這一觀點(diǎn)，但仍需要進(jìn)一步的試驗(yàn)予以證實(shí)。河南煙葉在腺毛密度較小的情況下仍表現(xiàn)出了較高的腺毛分泌物含量，說(shuō)明河南煙區(qū)煙葉腺毛物質(zhì)合成、分泌更加活躍，CYC-1和CYP71D16基因保持了較高的轉(zhuǎn)錄水平也支持了這一推論。

[1]David D L，Nielsen M T．Tobacco production,chemistry and technology[M].Oxford:Blackwell Science，1999：292-303．

[2]史宏志,劉國(guó)順．煙草香味學(xué)[M]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1998：83.

[3]粱志敏,冀浩,崔紅，等.施肥對(duì)煙草腺毛葉綠體體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2009，29(2)：291-295.

[4]張華，崔紅,冀浩,等.水分脅迫對(duì)煙草腺毛超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào),2012,32(1)：4-8.

[5]翁夢(mèng)玲,梁志敏,崔紅,等.遮蔭對(duì)煙草葉片腺毛形態(tài)結(jié)構(gòu)及分泌物含量的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008,42(6):613-616.

[6]冀浩,李雪君,趙永振,等.浸提葉面分泌物對(duì)烤煙品質(zhì)的影響[J].中國(guó)煙草科學(xué),2008,29(2):13-17.

[7]查宏波,蔡忠山.不同烤煙品種煙葉腺毛 密度的差異性[J].煙草科技,2003(10):43-44.

[8]劉彩云,常志隆,常愛霞,等.普通煙草品種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中葉表腺毛密度及其形態(tài)的比較[J].煙草科技,2011(5):71-73.

[9]唐遠(yuǎn)駒.試論特色煙葉的形成和開發(fā)[J].中國(guó)煙草科學(xué),2004,25(1):10-13.

[10]韓錦峰,王廣山,遠(yuǎn)彤,等.烤煙葉面分泌物的初步研究[J].中國(guó)煙草,1995,16(2):10-13.

[11]Schmidt G W,Delaney S K.Stable internal reference genes for normalization of real-time RT-PCR in tobacco(Nicotiana tabacum)during development and abiotic stress[J].Mol Genet Genomics,2010,283:233-241.

[12]時(shí)向東.烤煙葉片腺毛發(fā)育過(guò)程的掃描電鏡觀察[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,39(2):155-157.

[13]李鵬飛,周冀衡,張建平,等.不同烤煙品種成熟過(guò)程中腺毛密度及葉面分泌物含量的變化[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2008,34(3):293-297.

[14]Wang E,George J W.Elucidation of the functions of genes central to diterpene metabolism in tobacco trichomes using posttranscriptional gene silencing[J].Plant,2003,216:686-691.

[15]Wang E,Wang R,DeParasis J,et al.Suppression of a P450 hydroxylase gene in plant trichome glands enhances naturalproduct-based aphid resistance[J].Nature Biotechnology,2001,19(4):371-374．

[16]楊鐵釗.烤煙葉面腺毛密度及其分泌物變化動(dòng)態(tài)的相關(guān)分析[J].中國(guó)煙草科學(xué),2005,26(1):43-46.

[17]Court W A.Factors affecting the concentration of duvatrienediols of flue-cured tobacco[J].Tobacco Science,1982,24:40-43.

[18]李章海,王能如,王東勝,等.不同生態(tài)尺度煙區(qū)烤煙香型風(fēng)格的初步研究[J].中國(guó)煙草科學(xué),2009,30(5):67-70.

Comparative study in leaf trichome development and exudates in typical ecological regions

YANG Yongxia,WEI Yuewei,FENG Qi,WANG Xiaolong,WANG Jing,ZHAO Chennan,CUI Hong
College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China

Comparative study was conducted to determain trichomes morphology and densitites,exudates on leaf surface and gene expression by planting one tobacco(Nicotiana tabacumL.)variety K326 in three typical ecological regions,namely Pingdingshan of Henan province,Jiangchuan of Yunnan province,and Zunyi of Guizhou province.Results showed that no obvious difference was observed in trichome types,while trichome densities varied greatly between regions.Leaf trichome in Guizhou’s Zunyi proved to have the highest density,followed by that in Henan and Yunnan.Cembratriene-diol(CBT-diol),the main component of trichome exudates,registered the highest in tobacco leaf surface in Henan according to GC/MS..The expression ofCYC-1 and CYP71D16displayed same tendency with CBT-diol content.It indicated that ecological environment influenced development of leaf trichomes and metabolism,and further affected characteristics of tobacco leaves.

tobacco; trichome; density; exudate; gene expression

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.05.007

S572.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1004-5708（2014）05-0038-05

中國(guó)煙草總公司重點(diǎn)科技項(xiàng)目“煙草腺毛物質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)規(guī)律及調(diào)控研究”（110200902045）

楊永霞（1980—），博士，講師，研究方向?yàn)闊煵萆锛夹g(shù)，Tel：0371-63558121，Email：yyx624@126.com

崔紅（1966—），博士，教授，研究方向?yàn)闊煵萆锛夹g(shù)，Email：cuihonger_13@163.com

2013-11-23