達麗雋 李 華 張獻全(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科，重慶 400010)

肺癌是呼吸系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，也是全世界癌癥死亡的首要原因。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)大約占肺癌總數(shù)的80%，其中有40%的患者在確診時已屬中晚期，這些患者的5年生存率僅有10%左右［1］。順鉑聯(lián)合其他化療藥物是治療晚期NSCLC的主要方案，然而，順鉑耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)導(dǎo)致了治療的失敗［2］。Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種腫瘤中異常激活，包括 NSCLC［3］。該通路的激活依賴于Hh活性配體與其受體PTCH結(jié)合，解除對SMO的抑制，SMO將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給下游的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子Gli，引起靶基因的表達［4，5］，例如 cyclinD1、Bcl-2、VEGF等［6］。其中，cyclinD1能有效調(diào)控細(xì)胞從G1期到S期的轉(zhuǎn)化，從而促進細(xì)胞分裂;近年來，Bcl-2已被定義為新型耐藥基因，有文獻報道下調(diào)Bcl-2的表達能增強腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性［7-9］。因此，我們推測Shh-Gli信號通路可能參與了NSCLC的順鉑耐藥性。此外，相關(guān)文獻顯示Gli1的表達除了受Hedgehog信號通路的調(diào)控外，還受到其他致瘤信號通路的調(diào)控，包括TGF-β-Smads通路和PI3KAKT通路［10］，這表明Gli1在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著極其重要的作用。然而Gli1與順鉑耐藥是否相關(guān)至今仍未闡明。為此，本課題依據(jù)RNA干擾原理，設(shè)計并合成Gli1基因特異性小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染至肺癌A549/DDP細(xì)胞株，通過檢測相關(guān)蛋白、細(xì)胞對順鉑敏感性及凋亡率的變化，初步探討Gli1基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞順鉑耐藥的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人肺腺癌細(xì)胞株A549及耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP購自上海瑞鹿生物科技有限公司。

1.1.2 試劑 Gli1 siRNA、StealthRNAi Negative Control Duplexes購自Invitrogen公司;轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent購自Roche公司;RNAiso Plus(Total RNA提取試劑盒)、熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;Gli1、β-actin引物由生物工程(上海)有限公司設(shè)計并合成;Gli1、Bcl-2、cyclinD1、caspase-3、β-actin 抗體購自Abcam公司;Hoechst 33258、MTT細(xì)胞毒性檢測試劑盒、AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 向A549及A549/DDP細(xì)胞加入含10%胎牛血清(美國Gibco公司)的RPMI1640培養(yǎng)液(含 10 μg/ml青霉素及 10 μg/ml鏈霉素)，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d細(xì)胞換液，每4～5 d 0.25%胰酶消化細(xì)胞，1∶4傳代培養(yǎng)。

1.2.2 轉(zhuǎn)染 根據(jù)X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑說明書，轉(zhuǎn)染前1 d，6孔板收集細(xì)胞，無抗生素含血清培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1.0×105ml-1。次日，當(dāng)細(xì)胞融合度達50%左右時進行轉(zhuǎn)染。具體步驟如下:實驗組:A液:用90 μl Opti-MEM?I稀釋10 μl X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent，上下顛倒混勻 ;B 液:另取92.5 μl Opti-MEM?I稀釋 2 μg(7.5 μl)Gli1 siRNA，上下顛倒混勻;A液和B液在5 min之內(nèi)混合，室溫下靜置20 min。實驗組加入上述混合液，另加2 ml無雙抗無血清培養(yǎng)基，即總體積為2.2 ml，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后換成含10%胎牛血清不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液。陰性轉(zhuǎn)染組使用StealthTMRNAi Negative Control Duplexes代替Gli1 siRNA，空白對照組為等量培養(yǎng)基代替。

1.2.3 熒光定量PCR 按說明書提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。以 SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5 μl，上、下游引物(10 μmol/;L) 各 1 μl，模板cDNA 2 μl，dH2O 8.5 μl的反應(yīng)體系擴增 Gli1 基因，β-actin為內(nèi)參照。Gli1上游引物:5'-CTGGACCTGCAGACGGTTATC-3'，下游引物:5'-AGCCTCCTGGAGATGTGCAT-3'，產(chǎn)物長度 82 bp;β-actin 上游引物:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，產(chǎn)物長度205 bp。擴增條件:95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)后65℃延伸5 s，PCR產(chǎn)物根據(jù)Ct值進行相對定量分析。

1.2.4 Western blot 提取轉(zhuǎn)染后48 h的各組細(xì)胞的總蛋白，BCA法測定蛋白樣品濃度。每組分別取40 μg用以檢測相關(guān)蛋白表達量，依次進行 SDSPAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，經(jīng)5%脫脂牛奶(5 g脫脂奶粉溶于100 ml 1×PBST溶液中)封閉1 h后，分別以稀釋過的Gli1抗體、Bcl-2抗體、cyclinD1抗體、caspase-3抗體及β-actin抗體4℃孵育過夜，洗膜后以辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)37℃孵育1 h，再洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光染色 玻片滅菌處理后鋪于24孔板內(nèi)，將適量細(xì)胞接種于玻片上，次日進行轉(zhuǎn)染。24 h后4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min，加0.1%TritonX-100室溫放置30 s，經(jīng)5%山羊血清蛋白室溫封閉1 h后，孵一抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌后，以FITC標(biāo)記的二抗室溫避光孵育1 h，DAPI染核，PBS再洗滌，用抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 Hochest33258染色 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，按照Hochest33258染色液說明書進行染色，用熒光顯微鏡觀察核染色及凋亡小體的情況。

1.2.7 細(xì)胞周期測定 轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，70%乙醇固定，放于4℃冰箱過夜。次日，用流式細(xì)胞術(shù)進行細(xì)胞周期分析。

1.2.8 MTT法測定IC50 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板上，每孔4.0×103個.轉(zhuǎn)染后6 h加入不同濃度順鉑(終濃度分別為 1、2、4、8、16 μg/ml)，設(shè)三個復(fù)孔，同時設(shè)置陰性對照孔和空白對照孔。作用48 h后，每孔加入5 mg/ml四甲基偶氮唑藍(MTT)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，加 DMSO 150μl/孔，震蕩10 min，酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度。計算順鉑對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.9 Annexin V-FITC檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染6 h后，向各組細(xì)胞加入順鉑(10 μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用0.25% 胰酶消化收集細(xì)胞，PBS緩沖液輕輕重懸，進行Annexin V/PI雙染色測定細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以表示，獨立樣本采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549/DDP細(xì)胞耐藥指數(shù) MTT結(jié)果表明:相同順鉑濃度下A549細(xì)胞的抑制率明顯高于A549/DDP細(xì)胞(圖1A)。A549細(xì)胞的IC50為(2.38±0.31)μg/ml，A549/DDP 細(xì)胞的 IC50 為(16.75 ±0.54)μg/ml，其耐藥指數(shù)約為 7.04(P=0.000)，屬于中等耐藥細(xì)胞株(圖1B)。

2.2 Gli1在A549/DDP細(xì)胞中高表達 qPT-PCR和Western blot分別從mRNA和蛋白水平檢測兩種細(xì)胞中Gli1的表達。與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞中Gli1在基因(P=0.001)和蛋白水平(P=0.008)的表達均顯著增高(圖2)。

2.3 Gli1 siRNA有效抑制A549/DDP細(xì)胞中Gli1的表達 轉(zhuǎn)染后48 h，qPT-PCR檢測Gli1 mRNA相對表達量的變化，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48 h后實驗組的Gli1 mRNA水平顯著低于陰性轉(zhuǎn)染組及空白對照組(P=0.001，圖3A);Gli1蛋白的變化由Western blot和細(xì)胞免疫熒光染色來檢測，結(jié)果表明實驗組的Gli1蛋白表達量明顯低于陰性轉(zhuǎn)染組及空白對照組(P=0.001圖3B和3C)。

圖1 順鉑對A549及A549/DDP細(xì)胞的抑制率及IC50Fig.1 Cisplatin-inhibiting rate and DDP IC50 for A549 cells and A549/DDP cells

2.4 Gli1 siRNA對 A549/DDP細(xì)胞中 Bcl-2、cyclinD1和caspase-3蛋白表達的影響 Western blot用以檢測轉(zhuǎn)染后48 h各組細(xì)胞中Bcl-2、cyclinD1和caspase-3蛋白的表達水平。結(jié)果顯示實驗組Bcl-2、cyclinD1的表達量顯著低于陰性轉(zhuǎn)染組和空白對照組(P=0.003);而凋亡蛋白caspase-3在實驗組的表達量明顯高于在陰性轉(zhuǎn)染組和空白對照組中的表達(P=0.001，圖4)。

圖2 Gli1 mRNA、Gli1蛋白在A549和A549/DDP細(xì)胞中的表達Fig.2 Expression of Gli1 in A549 and A549/DDP cells

圖3 轉(zhuǎn)染Gli1 siRNA對A549/DDP細(xì)胞中Gli1表達的影響Fig.3 Inhibition of Gli1 expression by siRNA transfection

2.5 Gli1 siRNA對A549/DDP細(xì)胞自發(fā)性凋亡及細(xì)胞周期的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，利用Hochest 33258對細(xì)胞進行染色。熒光顯微鏡下可見實驗組發(fā)生核固縮和核亮染的細(xì)胞數(shù)量明顯多于陰性轉(zhuǎn)染組及空白對照組(圖5A)。

轉(zhuǎn)染48 h后，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期，各時期的細(xì)胞比例如下:實驗組:G1期(77.54% ±0.71%)，S期(17.72% ±0.66%)，G2(4.74% ±0.97%);陰性轉(zhuǎn)染組:G1期(62.47% ±1.15%)，S期(33.50% ±1.05%)，G2(4.07% ±0.38%);空白對照組:G1期(61.88% ±1.18%)，S期(32.93%±1.76%)，G2(5.16% ±0.61%)(P=0.000，圖5B)。實驗組有更多細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期G1期。

2.6 沉默Gli1后A549/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性顯著提高 以MTT法檢測轉(zhuǎn)染Gli1 siRNA 48 h后不同濃度順鉑對A549/DDP細(xì)胞的抑制率。結(jié)果顯示:實驗組、陰性轉(zhuǎn)染組、空白對照組細(xì)胞的IC50值分別為(2.65 ±0.85)μg/ml、(12.63 ±1.11)μg/ml、(13.81±1.14)μg/ml。實驗組對順鉑的敏感性顯著提高(P=0.000，圖6A)。Annexin V-FITC法檢測轉(zhuǎn)染Gli1 siRNA 48 h后，10 μg/ml順鉑誘導(dǎo)的各組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示:實驗組 35.19% ±3.92%;陰性轉(zhuǎn)染組6.43% ±0.11%;空白對照組5.01%±0.77%。與陰性轉(zhuǎn)染組與空白對照組相比，沉默Gli1基因能顯著提高順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率(P=0.000，圖6B)。

圖4 轉(zhuǎn)染 Gli1 siRNA對 A549/DDP細(xì)胞中 Bcl-2、cyclinD1和caspase-3蛋白的影響Fig.4 Effect of Gli1 depletion on expression of Bcl-2，cyclinD1 and caspase-3 proteins in A549/DDP cells.

圖5 轉(zhuǎn)染Gli1 siRNA對A549/DDP細(xì)胞自發(fā)性凋亡及細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effects of Gli1 depletion on spontaneous apoptosis and cell cycle of A549/DDP cells

圖6 轉(zhuǎn)染Gli1 siRNA后A549/DDP細(xì)胞對順鉑敏感性的變化Fig.6 Effects of Gli1 depletion on the susceptibility of A549/DDP cells to DDP

3 討論

Gli1是一種鋅指核轉(zhuǎn)錄因子，與Shh信號通路中下游基因的特定序列結(jié)合，直接調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄表達［11］。研究表明Gli1在多種腫瘤中異常激活，參與腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲與轉(zhuǎn)移、藥物耐藥等［12］，內(nèi)在機制都與Gli1調(diào)控其下游靶基因的表達有關(guān)。然而，Gli1的上調(diào)是否與肺癌細(xì)胞的順鉑耐藥性相關(guān)至今仍未闡明。

本實驗中，我們以耐順鉑的肺腺癌細(xì)胞A549/DDP及其親本細(xì)胞A549為細(xì)胞模型，MTT檢測得出該細(xì)胞株的耐藥指數(shù)為7.04，屬于中度耐藥。qRT-PCR、Western blot顯示與親本細(xì)胞A549相比，耐藥細(xì)胞A549/DDP中Gli1 mRNA和Gli1蛋白的表達水平均明顯上調(diào)，這預(yù)示著Gli1可能參與了肺癌細(xì)胞的順鉑耐藥。為了核實Gli1的這一作用，我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)將Gli1 siRNA轉(zhuǎn)染至A549/DDP細(xì)胞，使Gli1在mRNA和蛋白水平都達到了顯著抑制。同時發(fā)現(xiàn)Gli1下游靶基因Bcl-2、cyclinD1隨著Gli1基因的沉默也出現(xiàn)了明顯下調(diào)，應(yīng)用Hochest 33258對各組細(xì)胞進行染色，發(fā)現(xiàn)沉默Gli1可以誘導(dǎo)細(xì)胞自發(fā)性凋亡的發(fā)生。利用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)Gli1基因沉默后阻礙了細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，使停滯在G1期的細(xì)胞比例明顯高于對照組，這也證實了cyclinD1對細(xì)胞周期的調(diào)控作用。最后，我們應(yīng)用MTT法和Annexin V-FITC法闡明了Gli1與肺癌順鉑耐藥的關(guān)系，即沉默Gli1能提高A549/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性。

綜上所述，我們的研究證實Gli1在耐順鉑的肺腺癌細(xì)胞株A549/DDP中異常激活。利用RNA干擾技術(shù)，我們最大限度地抑制了Gli1基因的表達，從而導(dǎo)致了A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥性的顯著逆轉(zhuǎn)。本研究首次在NSCLC細(xì)胞中探討了Gli1與順鉑耐藥的關(guān)系，為下一步建立動物耐藥模型，進行逆轉(zhuǎn)耐藥的體內(nèi)實驗研究奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)然，腫瘤細(xì)胞耐藥的調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，涉及多個基因，多條途徑［13］，其中的機理和相互作用關(guān)系尚待進一步闡明。

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