馬旭怡 徐海燕 何小舟 董盼盼 薛 冬 張雁云 張學(xué)光

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院泌尿外科實(shí)驗(yàn)室，常州 213003)

腎移植是終末期腎病的最佳治療手段，其短期存活率已經(jīng)得到顯著提高，但是長期存活率仍然不能讓人滿意。引起移植腎功能逐漸喪失的原因包括非免疫因素和免疫因素兩個(gè)方面，而免疫介導(dǎo)的移植排斥被認(rèn)為是影響移植腎長期存活的主要因素。

自Terasaki提出“移植排斥的體液免疫”理論以來，抗體介導(dǎo)的移植排斥對移植腎長期存活的影響得到越來越多的重視［1-3］。B細(xì)胞活化因子(B cell activating factor belonging to the TNF family，BAFF)屬于腫瘤壞死因子超家族。BAFF信號對B細(xì)胞的分化發(fā)育、增殖等發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。本項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，BAFF信號參與腎移植術(shù)后抗體介導(dǎo)的排斥，與腎移植長期存活密切相關(guān)［4，5］。BAFF 是具有生物功能的細(xì)胞因子，BAFF信號異常提示患者體內(nèi)已經(jīng)存在某種異常的免疫應(yīng)答，因而監(jiān)測BAFF信號并不能很好地預(yù)警患者的體液免疫狀態(tài)。研究亦已發(fā)現(xiàn)，microRNA是基因表達(dá)的重要調(diào)控因子［6，7］。理論上可以認(rèn)為，存在某種或者某幾種調(diào)控BAFF表達(dá)的microRNA。本項(xiàng)目組前期完成了以BAFF、C4d高表達(dá)的急性移植腎排斥組織為試驗(yàn)組，和以BAFF、C4d不表達(dá)的間質(zhì)纖維化/腎小管萎縮的移植腎組織為對照組進(jìn)行的microRNA芯片試驗(yàn)。生物信息學(xué)分析顯示 miR-338-5p在BAFF、C4d高表達(dá)的急性移植腎排斥組織中顯著低表達(dá)。對miR-338-5p進(jìn)行深入生物信息學(xué)分析，結(jié)果提示miR-338-5p可能直接或者間接調(diào)控BAFF參與急性腎移植排斥的過程［8］。

為進(jìn)一步了解miR-338-5p在腎移植患者的表達(dá)特點(diǎn)，及其對BAFF信號的調(diào)控作用，本項(xiàng)研究檢測了腎移植患者血清miR-338-5p的水平，以及與抗體介導(dǎo)排斥密切相關(guān)的分子sBAFF、抗HLA抗體、抗MICA抗體等，統(tǒng)計(jì)分析miR-338-5p與這些分子的相關(guān)性，進(jìn)而分析miR-338-5p在腎移植術(shù)后抗體介導(dǎo)排斥中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象的一般臨床資料如表1所示。選擇2009年4月到2013年5月在蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院進(jìn)行隨訪的腎移植患者共49例，其中男38例，女11例。均為首次腎移植。術(shù)后常規(guī)服用甲基強(qiáng)的松龍(MP)、酶酚酸酯(MMF)和環(huán)孢素(CsA)/他克莫司(FK506)三聯(lián)免疫抑制治療。有患者曾應(yīng)用過胸腺球蛋白或抗IL-2抗體(Basiliximab)。但所有患者均沒有服用過抗CD20單抗(Rituximab)。同時(shí)選取20名健康志愿者作為對照組，志愿者各項(xiàng)檢查指標(biāo)均在正常范圍，均無各種急慢性疾病，無自身免疫病。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集所有研究對象的外周血2 ml(EDTA抗凝)，于10℃下3 500 r/min離心5 min，收集上清，置－80℃冰箱保存。

1.2.2 從血清中提取RNA 按試劑盒miRNeasy Serum/Plasma Kit(QIAGEN公司)操作說明，提取血清中總RNA;采用分光光度計(jì)(BECKMAN COULTER公司，DU 800系列)檢測RNA濃度及純度。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR用引物制劑由大連TaKaRa公司設(shè)計(jì)并合成，miR-338-5p引物序列為:5'-AACAAUAUCCUGGUGCUGAGU-3'。U6b作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)源性參照。采用試劑盒 SYBR?PrimerScriptTMmiRNA RT-PCR Kit(TaKaRa公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、兩步法real-time PCR。簡述如下:(1)逆轉(zhuǎn)錄過程:37℃逆轉(zhuǎn)錄60 min，85℃ 5 s滅活逆轉(zhuǎn)錄酶;(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司，7500系列)進(jìn)行 PCR反應(yīng):第一階段 :95℃ 30 s;第二階段:95℃ 5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)。miR-338-5p的相對表達(dá)量采用2－ΔΔCt來表示(ΔCt=CtmiR-338-5p － CtU6b)。每例標(biāo)本重復(fù)兩次，取其平均值。

1.2.4 ELISA法檢測血清中可溶性BAFF水平采用Human BAFF/BLys/TNFSF13B Immunoassay試劑盒(R＆D systems)，按試劑盒操作說明檢測血清中sBAFF的水平。每例標(biāo)本重復(fù)兩次，取其平均值。

1.2.5 Luminex檢測腎移植患者血清抗HLA-Ⅰ類抗體、抗HLA-Ⅱ類抗體、抗 MICA抗體的表達(dá)

采 用 OneLambda公 司 LABScreenMix(LSM12)試劑盒檢測血清中抗HLA-Ⅰ抗體、抗HLA-Ⅱ抗體、抗MICA抗體，操作簡述如下:(1)將待測樣本12 000 r/min離心5 min去除聚合物;(2)加樣板每孔中加入2 μl微珠，然后每孔加入14 μl 1 × PBS;(3)樣本離心后，加入7 μl血清樣本;(4)用封口膜封嚴(yán)，并用混勻器混勻;(5)室溫避光孵育30分鐘，孵育過程中輕輕混勻幾次;(6)清洗:孵育結(jié)束后，每孔加入180 μl 1×Labscreen wash buffer，封口膜封嚴(yán)，用混勻器混勻，3 500 r/min離心5 min，快速將洗液甩入廢物箱中，重復(fù)清洗3次;(7)每孔加入50 μl二抗，用混勻器混勻;(8)室溫避光孵育30分鐘，孵育過程中輕輕混幾次;(9)二次孵育后，3 500 r/min離心5 min，然后將二抗甩到廢物箱中;(10)清洗:重復(fù)步驟6兩次;(11)清洗完成后，每孔加入60 μl 1×PBS，用混勻器混勻樣本，將樣本轉(zhuǎn)移到讀板中，上機(jī)讀取結(jié)果;(12)采用軟件Fusion2.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。平均熒光強(qiáng)度(MFI)值≥1 000時(shí)，被認(rèn)為陽性;MFI值＜500時(shí)，被認(rèn)為是陰性;MFI值 ＞500＜1 000時(shí)，則被認(rèn)為可疑陽性。

表1 一般臨床資料()Tab.1 General clinical data()

表1 一般臨床資料()Tab.1 General clinical data()

Groups(Male/Female)Serum creatinine(μmol/L)Age(year)Transplantation time(month)209±157 40±8.5 3.5±2.8 1－3 years(5/0) 160±82 39±15 25±8 3－5 years(4/2) 130±14 45±8 53±6＞5 years(15/4) 230±99 53±9 119±46 Volunteers(13/7)Recipients ＜1 year(14/5)－ 41±12.5 －

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有的數(shù)據(jù)以表示，采用 t檢驗(yàn)進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)間的比較，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;采用卡方檢驗(yàn)檢測各組間抗體陽性率的差異;采用Spearman法對miR-338-5p和 sBAFF、miR-338-5p和抗 HLA-Ⅱ抗體進(jìn)行相關(guān)性分析;采用Pearson法對抗體和sBAFF進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-338-5p在腎移植患者血清的表達(dá)特點(diǎn)熒光定量PCR結(jié)果顯示，移植患者血清miR-338-5p水平顯著低于健康組(2.79±2.5 vs 0.09±0.12，P＜0.001)(如圖1A所示)。腎移植術(shù)后1、3年以內(nèi)者血清miR-338-5p水平分別顯著低于移植術(shù)后1、3年以上者(0.04±0.04 vs 0.13±0.14、0.05±0.04 vs 0.14±0.14，P ＜0.01)，兩組與健康組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(如圖1B、C所示);腎移植術(shù)后5年以內(nèi)者血清中miR-338-5p水平與移植5年以上者差異不顯著(0.08±0.1 vs 0.11±0.13，P＞0.05)，但兩組與健康對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(如圖1D所示)。

2.2 sBAFF在腎移植患者血清的表達(dá)特點(diǎn) 對ELISA獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示，腎移植患者血清中sBAFF水平顯著高于健康組［(1 321±950)pg/ml vs(534 ±327)pg/ml，P ＜0.01］(如圖 2 所示)。而腎移植術(shù)后不同時(shí)間各組間血清中sBAFF水平差異均不顯著(P＞0.05)。

2.3 腎移植患者血清中抗體陽性率的分布特點(diǎn)腎移植患者血清中各抗體陽性率與健康組的比較顯示，健康組各抗體陽性率均小于移植組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。術(shù)后1年內(nèi)患者血清中抗MICA抗體(P＜0.01)和抗HLA＆MICA抗體(P＜0.05)的陽性率小于術(shù)后1年以上者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后3年內(nèi)患者血清中抗MICA抗體(P＜0.01)和抗HLA＆MICA抗體(P＜0.01)的陽性率小于術(shù)后3年以上者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后5年內(nèi)患者血清中抗HLA＆MICA抗體(P＜0.01)的陽性率小于術(shù)后5年以上者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(如圖3所示)。

2.4 血清miR-338-5p與sBAFF的相關(guān)性分析 采用Spearman法分析所有研究對象血清中miR-338-5p與 sBAFF的相關(guān)性，結(jié)果顯示 miR-338-5p與sBAFF呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 －0.51(P＜0.001)(如圖4所示)。

圖1 腎移植患者和健康組血清中miR-338-5p表達(dá)水平的比較Fig.1 Comparison of serum miR-338-5p levels between renal transplantation recipients and volunteers

圖3 腎移植患者和健康組血清中各抗體陽性率的比較Fig.3 Comparison of serum antibody positive rate between renal transplantation recipients and volunteers

圖2 腎移植患者與健康組血清sBAFF水平的比較Fig.2 Comparison of serum sBAFF levels between renal transplantation recipients and volunteers

圖4 血清中sBAFF與miR-338-5p水平相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between serum sBAFF and miR-338-5p

2.5 各種抗體與sBAFF的相關(guān)性分析 各抗體MFI值小于1000時(shí)與sBAFF相關(guān)性均不顯著(P＞0.05);抗MICA抗體MFI值大于1000時(shí)與sBAFF呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=－0.579(P＜0.05)(如圖5所示);抗HLA＆MICA抗體MFI值大于1000時(shí)與sBAFF呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=－0.428(P＜0.05)(如圖6所示)。

圖5 血清中sBAFF與anti-MICA antibody水平相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between serum sBAFF and anti-MICA antibody

圖6 血清中sBAFF與anti-HLA＆MICA antibody水平相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between serum sBAFF and anti-HLA＆MICA antibody

圖7 血清中miR-338-5p與anti-HLAⅡantibody水平相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis between serum miR-338-5p and anti-HLAⅡantibody

2.6 各抗體MFI值與miR-338-5p的相關(guān)性分析血清 miR-338-5p與抗 HLA-Ⅰ類抗體、抗 MICA抗體、抗HLA抗體、抗HLA＆MICA抗體均無顯著相關(guān)性;采用Spearman法分析所有研究對象血清中miR-338-5p水平與抗HLA-Ⅱ抗體水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-338-5p與HLA-Ⅱ呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為－0.322(P＜0.05)(如圖7所示)。

3 討論

腎移植術(shù)后ABMR主要由受者體內(nèi)的抗同種供體HLA分子、血ABO同種凝集素或者抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體介導(dǎo)的一類排斥反應(yīng)，是影響移植腎長期存活的重要原因［9-13］。在急性ABMR過程中，高效價(jià)的抗體導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)的激活和移植物內(nèi)皮組織的溶解性損傷。臨床癥狀重，救治困難，對大劑量激素沖擊治療無效，預(yù)后很差。慢性ABMR主要表現(xiàn)為慢性移植物腎病(CAN)，尚缺乏理想的治療方案［13］，目前臨床上以支持治療為主，如以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACE1)/血管緊張素受體拮抗劑(ARB)、血脂調(diào)節(jié)藥物等藥物治療。因此進(jìn)一步探討ABMR的確切機(jī)制具有重要的理論和臨床意義。

為了深入研究miR-338-5p與BAFF信號的相關(guān)性，及其在ABMR過程中的可能作用，本項(xiàng)研究以隨訪的腎移植受者為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎移植受者血清miR-338-5p水平顯著低于健康組，且不同移植時(shí)間組間血清miR-338-5p水平有顯著差異;相關(guān)性分析顯示miR-338-5p水平與sBAFF水平顯著負(fù)相關(guān)。表明miR-338-5p參與腎移植術(shù)后機(jī)體的某種生理或病理過程，且對BAFF信號具有直接或間接的調(diào)控作用。

有報(bào)道表明腎移植患者血清sBAFF水平與移植腎功能正常與否有關(guān)。如Lehnhardt等［14］研究顯示兒童腎移植患者血清中sBAFF水平顯著升高、腎小球?yàn)V過率小于60 ml/mim的移植患者血清sBAFF顯著高于腎功能正常的患者。本項(xiàng)目組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，在移植腎功能異常的腎移植受者外周血單個(gè)核細(xì)胞上BAFF水平增高，而sBAFF水平與移植腎功能是否正常沒有顯著相關(guān)性［4］。本組研究得到與前期研究相似的結(jié)果(腎移植功能異常組:1495±1392 pg/ml vs腎移植功能正常組:1219±562 pg/ml，P＞0.05)。本組研究中所有參選對象均沒有服用過如抗CD20單抗、抗CD52單抗等可能致BAFF水平異常增高的制劑。故可以排除藥物原因所致的BAFF水平異常增高。造成與國外研究結(jié)果差異的原因尚待深入探究。

由于本組研究是以隨訪的腎移植患者為研究對象，并沒有取得所有參選患者的移植腎活檢組織，因而沒有能夠進(jìn)一步分析miR-338-5p表達(dá)水平與移植腎病理的相關(guān)性。但是研究中以腎移植隨訪患者的移植腎功能是否正常進(jìn)行分組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-338-5p水平在移植腎功能正常組與異常組間沒有顯著差異。引起移植腎功能下降的原因包括免疫因素和非免疫因素等多個(gè)方面，而只是以移植腎功能是否正常來分組并不一定適合于研究miR-338-5p表達(dá)狀況。本研究中同時(shí)檢測了各同種抗體的表達(dá)水平，分析了miR-338-5p與sBAFF、及各同種抗體的相關(guān)性，結(jié)果顯示抗同種抗體的產(chǎn)生與sBAFF水平的變化有時(shí)間差，抗同種抗體的產(chǎn)生落后于sBAFF水平的變化。提示檢測腎移植受者血清sBAFF水平具有警示作用，sBAFF水平增高提示機(jī)體產(chǎn)生抗同種抗體的能力增強(qiáng)。同時(shí)研究亦顯示miR-338-5p與抗HLA-Ⅱ抗體顯著負(fù)相關(guān)，這一結(jié)果顯示miR-338-5p與抗同種抗體的產(chǎn)生是密切相關(guān)的。但以術(shù)后3年為界進(jìn)行分組分析時(shí)miR-338-5p與抗同種抗體的相關(guān)性分別為(術(shù)前3年)負(fù)相關(guān)、(術(shù)后3年)正相關(guān)。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因?qū)⒃诮窈蟮墓ぷ髦猩钊胩接憽?/p>

microRNA是一類長度約22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，主要通過與靶基因的3'-非編碼區(qū)(3'-Untranslated Regions，UTR)結(jié)合來調(diào)控靶基因，參與生物體正常發(fā)育的調(diào)節(jié)等重要生命活動(dòng)過程［15，16］。研究亦已發(fā)現(xiàn)，多種microRNAs參與腎移植后抗體介導(dǎo)的排斥和細(xì)胞介導(dǎo)的排斥，并且與移植免疫耐受相關(guān)［17-22］。

miR-338-5p是長為22個(gè)核苷酸的微小RNA。對miR-338-5p的研究相對較少。新近報(bào)道，聯(lián)合檢測 miR-338-5p、miR-193a-3p、miR-23a可以有效監(jiān)測早期直腸癌［23］。而miR-338-5p與腎移植的相關(guān)研究目前僅限于本項(xiàng)目組。通過TargetScan和miR-Walk等數(shù)據(jù)分析平臺預(yù)測miR-338-5p的靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn) miR-338-5p具有608個(gè)靶基因，包括TRAF3和NF-κB1等。TRAF3是BAFF信號傳導(dǎo)的重要轉(zhuǎn)接蛋白，而NF-κB1途徑是重要的BAFF信號之一。信息學(xué)分析提示，miR-338-5p可能通過靶向作用于TRAF3和 NF-κB1而間接作用于 BAFF信號。靶點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，miR-338-5p對TRAF3和NF-κB1均具有靶向調(diào)控作用［8］。因而，有關(guān) miR-338-5p與BAFF信號之間的作用關(guān)系將在后續(xù)工作中深入研究。

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