高秀蓮 邢美云 王 麗 郭鈺琪 周憲賓 張巧鳳 張洪海 姚成芳 姜國(guó)勝 李 霞

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所腫瘤免疫與中藥免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250062)

正常骨代謝是成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨丟失之間的平衡過(guò)程，骨代謝失衡將導(dǎo)致骨疾病的發(fā)生［1］。已證實(shí)雌激素參與了骨代謝過(guò)程，雌激素缺乏狀態(tài)下骨丟失加速，易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、骨折等骨代謝性疾病，嚴(yán)重影響患者健康，但其發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明。目前治療主要采用雌激素替代療法，取得一定療效，但存在誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、乳腺癌、代謝紊亂等危險(xiǎn)，因此臨床亟待開(kāi)發(fā)防治雌激素缺乏骨丟失療效確切且副作用小的藥物與方法。隨著系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究不斷深入，證實(shí)機(jī)體骨代謝系統(tǒng)與內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)之間存在著密切聯(lián)系，三者形成內(nèi)分泌-免疫-骨代謝調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，在骨代謝過(guò)程發(fā)揮著復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控作用［2］。T細(xì)胞是免疫調(diào)節(jié)的主體，Th17、Treg亞群的發(fā)現(xiàn)使經(jīng)典的Th1/Th2模式擴(kuò)展為T(mén)h1/Th2/Th17/Treg模式［3］。不同T細(xì)胞亞群產(chǎn)生特異性細(xì)胞因子，在機(jī)體抵抗病原體感染、維持機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用，其亞群失衡參與了多種自身性免疫疾病及代謝性疾病的發(fā)生，但其在雌激素缺乏骨丟失中的作用尚未明確［4］。本研究通過(guò)建立雌激素缺乏骨丟失小鼠動(dòng)物模型，觀察雌激素缺乏狀態(tài)下Th1/Th2/Th17/Treg亞群偏移狀態(tài)，探討其與雌激素缺乏骨丟失的相關(guān)性，以期進(jìn)一步揭示雌激素缺乏骨丟失的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供新的靶點(diǎn)與途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠，由北京維通利華有限公司提供，鼠齡10周，體重(22±2)g，置于室溫24℃，相對(duì)濕度60%～65%的超凈動(dòng)物飼養(yǎng)柜內(nèi)，給予12 h光照，12 h暗室，自由飲水?dāng)z食。

1.2 主要試劑 大鼠抗小鼠熒光抗體:PC5-CD25、FITC-CD4、PE-TNFα、PE-IL-4、PE-IL-17A、PE-Foxp3均購(gòu)自美國(guó)BD Pharmigen公司;雌二醇ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組及卵巢切除組，各10只。

1.3.2 動(dòng)物處理 小鼠禁食12～18 h，10%水合氯醛注射液按100 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，卵巢切除經(jīng)腹腔行常規(guī)手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組不切除卵巢，僅切除卵巢周?chē)c卵巢等大的脂肪組織。術(shù)后自由進(jìn)食水，12周后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.3 標(biāo)本收集 末次給藥后1 h小鼠眼球取血，頸椎脫臼處死，分離血清，ELISA法檢測(cè)E2水平;無(wú)菌分離脾臟，200目銅網(wǎng)研磨過(guò)濾，冷PBS沖洗，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用于流式胞內(nèi)外因子雙染色檢測(cè);取右側(cè)股骨，剔除軟組織，用于BMD檢測(cè)。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)血清E2水平 按ELISA試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定血清E2。

1.3.5 骨密度測(cè)定 雙能X射線(xiàn)骨密度儀測(cè)量小鼠股骨前后位BMD。

1.3.6 流式抗體標(biāo)記與檢測(cè) 收集脾臟單個(gè)核細(xì)胞(1×106/管)，加入大鼠血清，室溫避光孵育30 min。將外標(biāo)抗體(FITC-CD4、PC5-CD25)按說(shuō)明書(shū)分別加入到細(xì)胞懸液中，4℃避光孵育30 min。冷1×PBS 洗2次;去上清，加入100 μl固定液，4℃避光孵育30 min。冷1×PBS洗1次，加入100 μl穿膜液重懸細(xì)胞，將內(nèi)標(biāo)抗體(PE-TNFα、PE-IL-4、PEIL-17A、PE-Foxp3)加入細(xì)胞懸液中，4℃避光孵育12 h。加入1 ml穿膜液洗1次，去上清，冷1×PBS洗2次，1×PBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)管，上機(jī)檢測(cè)。采用Winmidi 2.9分析Th1亞群(CD4+TNFα+)、Th2亞群(CD4+IL-4+)、Th17亞群(CD4+IL-17A+)及Treg亞群(CD4+CD25+Foxp3+)比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5軟件分析，計(jì)量資料以表示，采用One Way-ANOVA方差分析，數(shù)據(jù)間相關(guān)性用Pearson相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)(r值)為正，表示正相關(guān)，r值為負(fù)，表示負(fù)相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清E2水平比較 與正常組及假手術(shù)組比較，卵巢切除組小鼠E2水平顯著降低(P＜0.05)，證實(shí)雌激素缺乏小鼠模型建立成功，見(jiàn)圖1。

2.2 各組小鼠骨密度比較 與正常組及假手術(shù)組比較，卵巢切除組小鼠股骨骨密度顯著降低(P＜0.05);假手術(shù)組與正常組小鼠比較，股骨骨密度無(wú)顯著性差異;證實(shí)雌激素缺乏狀態(tài)導(dǎo)致骨丟失，見(jiàn)圖2。

2.3 各組小鼠Th1/Th2亞群比例變化 與正常組及假手術(shù)組比較，卵巢切除組小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞Th1亞群比例顯著升高(P＜0.05)，Th2亞群比例顯著降低(P＜0.05)，Th1/Th2比值明顯升高(P＜0.05)，提示雌激素缺乏骨丟失狀態(tài)存在Th1/Th2亞群向Th1偏移現(xiàn)象，見(jiàn)圖3。

2.4 各組小鼠Th17/Treg亞群比例變化 與正常組及假手術(shù)組比較，卵巢切除組小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞Th17亞群比例顯著升高(P＜0.05)，Treg亞群比例顯著降低(P＜0.05)，Th17/Treg比值明顯升高(P＜0.05)，提示雌激素缺乏骨丟失狀態(tài)存在Th17/Treg亞群向Th17偏移現(xiàn)象，見(jiàn)圖4。

圖2 股骨骨密度比較Fig.2 Comparison of BMD of thigh bone

圖3 Th1/Th2亞群比例變化Fig.3 Paradigm of Th1/Th2 subsets

2.5 E2、骨密度、T細(xì)胞亞群相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示E2水平與骨密度、Th2亞群比例、Treg亞群比例呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，與Th1亞群比例、Th17亞群比例呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05);骨密度與Th1、Th17亞群比例呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與Th2、Treg亞群比例呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，見(jiàn)表1。相關(guān)性結(jié)果提示T細(xì)胞亞群在維持正常骨代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，雌激素缺乏導(dǎo)致的T細(xì)胞亞群失衡狀態(tài)可能在骨丟失中扮演了重要角色，靶向逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞亞群失衡的方法可能成為減輕雌激素缺乏骨丟失的有效途徑。

圖4 Th17/Treg亞群比例變化Fig.4 Paradigm of Th17/Treg subsets

表1 E2、骨密度、T細(xì)胞亞群比例相關(guān)性Tab.1 Correlation analysis of E2，BMD and paradigm of T-cell subsets

3 討論

雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥等骨代謝疾病嚴(yán)重危害患者健康，給家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)，成為世界范圍內(nèi)日益受到關(guān)注的健康問(wèn)題。目前西醫(yī)治療雌激素缺乏骨丟失相關(guān)疾病主要采用雌激素替代療法，但存在誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)及代謝紊亂等副反應(yīng)。因此，進(jìn)一步闡釋雌激素缺乏導(dǎo)致骨丟失的機(jī)制，將為尋找預(yù)防或治療雌激素缺乏骨丟失療效確切、副作用小的方法與藥物提供科學(xué)依據(jù)。

隨著系統(tǒng)研究的不斷深入，證實(shí)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和骨代謝系統(tǒng)間存在密切聯(lián)系，三個(gè)系統(tǒng)間共享多種調(diào)控分子，包括細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、受體及信號(hào)分子等，一個(gè)系統(tǒng)的生理病理狀態(tài)不可避免地影響另一個(gè)系統(tǒng)［5］。雌激素是重要的性激素，T細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中重要的細(xì)胞群體，雌激素-T細(xì)胞-骨代謝三者的關(guān)系成為目前本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。已證實(shí)T細(xì)胞上存在雌激素受體，雌激素水平變化可直接影響T細(xì)胞增殖、活化和亞群極化，雌激素缺乏可誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1漂移，導(dǎo)致T細(xì)胞亞群極化失衡［6］。正常小鼠去卵巢后發(fā)生骨質(zhì)疏松，而裸鼠去卵巢后骨量并未丟失，提示雌激素誘導(dǎo)的T細(xì)胞亞群極化狀態(tài)對(duì)骨代謝有重要調(diào)節(jié)作用［7］，但雌激素缺乏對(duì)T細(xì)胞亞群(Th1/Th2/Treg/Th17)極化的影響在雌激素缺乏導(dǎo)致的骨丟失中究竟發(fā)揮著怎樣的作用尚缺乏系統(tǒng)研究。

初始T細(xì)胞遇抗原刺激后在特異性核轉(zhuǎn)錄因子與分化誘導(dǎo)因子作用下，分化為T(mén)h1/Th2/Th17/Treg等亞群，分泌特征性細(xì)胞因子，主導(dǎo)不同的免疫反應(yīng)。Th1、Th2是經(jīng)典的 T細(xì)胞亞群，Th1/Th2亞群平衡在維持正常骨代謝中具有重要作用。Th1亞群產(chǎn)生TNFα等促骨吸收因子，能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，促進(jìn)骨吸收作用［8］。Th2類(lèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生IL-4等細(xì)胞因子，抑制 NF-κB的受體活化配基(RANKL)誘導(dǎo)的生理性骨吸收和TNFα誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成與成熟，進(jìn)而抑制骨吸收，減少骨丟失［9］。Th17和Treg產(chǎn)生于同一前體細(xì)胞，分化過(guò)程受多種相同誘導(dǎo)因子及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，Th17/Treg亞群平衡在維持正常骨代謝中發(fā)揮著重要作用［10］。Th17通過(guò)產(chǎn)生IL-17A等細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在機(jī)體防御病原微生物感染中發(fā)揮重要作用，但其過(guò)度表達(dá)則可造成機(jī)體組織損傷［11］。有研究報(bào)道雌激素缺乏狀態(tài)能誘導(dǎo)分泌IL-17的Th17亞群，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞活化，提示Th17在雌激素缺乏導(dǎo)致的骨丟失中扮演了重要角色［12］。Treg高表達(dá)CD25，F(xiàn)oxp3是其特異性核轉(zhuǎn)錄因子，Treg通過(guò)產(chǎn)生TGF-β等細(xì)胞因子或通過(guò)細(xì)胞間直接接觸發(fā)揮免疫抑制與調(diào)節(jié)作用，能夠通過(guò)抑制破骨細(xì)胞功能減少骨丟失［13］。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，雌激素缺乏導(dǎo)致的骨丟失狀態(tài)存在著Th1類(lèi)細(xì)胞因子TNFα表達(dá)升高［14］，提示T細(xì)胞亞群偏移可能參與了雌激素缺乏骨丟失的過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢小鼠雌激素水平顯著降低，同時(shí)骨密度顯著下降，E2水平與骨密度呈顯著正相關(guān)，證實(shí)雌激素缺乏狀態(tài)導(dǎo)致骨丟失。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，雌激素缺乏狀態(tài)下，Th1、Th17亞群比例顯著升高，Th2、Treg亞群比例顯著降低，T細(xì)胞平衡向Th1、Th17亞群偏移。相關(guān)性分析顯示E2水平及骨密度均與Th1、Th17亞群比例呈顯著負(fù)相關(guān)，與Th2、Treg亞群比例呈顯著正相關(guān)，提示雌激素缺乏誘導(dǎo)的T細(xì)胞亞群失衡參與了骨丟失過(guò)程，靶向逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞亞群失衡的方法可能成為減輕雌激素缺乏骨丟失的有效途徑。本研究進(jìn)一步闡釋了雌激素缺乏骨丟失的發(fā)病機(jī)制，為靶向逆轉(zhuǎn)雌激素缺乏導(dǎo)致的T細(xì)胞亞群失衡狀態(tài)減輕骨丟失提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但雌激素缺乏狀態(tài)T亞群分化失衡影響破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞分化與功能的確切分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探討。

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