薛茜文，黃鑫，郝翠芳＊

（1.山東青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青島 266021；2.山東煙臺毓璜頂醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，煙臺 264000）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡婦女最常見的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病之一，發(fā)病率高達(dá)5%～10%［1］，也是女性無排卵性不育的常見原因，臨床表現(xiàn)高度異質(zhì)性，表現(xiàn)為：月經(jīng)紊亂，無排卵或稀發(fā)排卵，雄激素過多，不少患者伴有胰島素抵抗，導(dǎo)致高胰島素血癥［2］。PCOS患者無排卵或稀發(fā)排卵的主要原因是優(yōu)勢卵泡的募集過程障礙。卵泡的發(fā)育成熟的全過程涉及到較多的激素調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及血管形成。卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間復(fù)雜的“對話機(jī)制”在卵泡成熟過程中起著重要的作用，并對受精及胚胎的發(fā)育過程有著一定的影響［3］。卵泡的成熟過程遵循減數(shù)分裂，分為胞核和胞質(zhì)兩方面的成熟。卵的核成熟可以分為三個時期：germinal vesicle（GV）、metaphase I（M I）和 metaphaseⅡ （MⅡ）［4，5］。在核成熟過程的終極階段，卵通過排出第一極體（PB）進(jìn)入MⅡ期，達(dá)到成熟期，進(jìn)而才有可能能完成正常受精［6］。

血管生成素樣蛋白1和2（ANGPTL1和ANGPTL2）隸屬于血管生成素樣蛋白家族成員，參與調(diào)節(jié)血管的發(fā)生。在內(nèi)皮細(xì)胞表面，ANGPTL1和ANGPTL2通過未知受體發(fā)揮作用來調(diào)節(jié)血管生成，根據(jù)所處的環(huán)境不同，可能是促進(jìn)血管生成，也可能是抑制血管生成［7］。ANGPTL1 和ANGPTL2均是通過磷脂酰肌醇3－激酶途徑（PI3－K）／Akt途徑發(fā)揮作用，并且他們的共同活性很有可能在斑馬魚胚胎發(fā)育的過程起重要作用［8，9］，但是關(guān)注點卻在斑馬魚上，并未在人類身上展開其相關(guān)研究。有研究［10］證實，卵泡液中 ANGPT1和ANGPT2水平的改變很有可能與排卵前卵母細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)。有研究［6］采用基因芯片技術(shù)證明，比起MⅠ時期的卵母細(xì)胞，MⅡ時期卵母細(xì)胞的卵丘顆粒細(xì)胞（CC）上ANGPTL1基因的高水平表達(dá)，進(jìn)一步說明了ANGPTL1亦在基因水平參與卵泡的發(fā)育，但是并未篩選到基因ANGPTL2。近來越來越多的文獻(xiàn)開始傾向于研究不同卵母細(xì)胞成熟期（GV、MⅠ、MⅡ）對應(yīng)的 CC上不同的基因的表達(dá)［6，11］，并且不僅僅局限于壁層或黃體顆粒細(xì)胞［12］。

本文采用實時熒光定量聚酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）來研究經(jīng)過促排卵周期治療的PCOS患者的MⅡ時期的CC上ANGPTL1和ANGPTL2基因的差異性表達(dá)。通過與非PCOS（non－PCOS）患者M(jìn)Ⅱ時期CC上相應(yīng)基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析，進(jìn)而充分把握存在于PCOS和non－PCOS患者間控制卵核成熟的分子機(jī)制。

資料和方法

一、患者的選擇

收集2013年1月～6月在煙臺毓璜頂生殖中心就診的PCOS患者38例作為實驗組，PCOS的診斷均符合鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，具備以下特征：長期稀發(fā)排卵或無排卵，雄激素分泌過多和多囊卵巢等特征，并排除庫欣綜合征、先天性腎上腺增生及一些分泌雄激素的腫瘤；另選取同期相同年齡段因男方因素不育就診的non－PCOS患者42例為對照組，且婦女月經(jīng)周期規(guī)律及內(nèi)分泌均正常。本研究經(jīng)本院臨床研究倫理委員會批準(zhǔn)，所有實驗對象均滿足以下特征（表1），且均簽署相關(guān)知情同意書。

表1 臨床患者指標(biāo)（ ±s）

表1 臨床患者指標(biāo)（ ±s）

注：與non－PCOS組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 n 年齡（歲）BMI（kg／m2）基礎(chǔ)LH／FSH基礎(chǔ)睪酮（nmol／L）AFC（個）總rFSH（IU）受精率（%）Non－PCOS 42 31.5±2.5 22.6±3.7 4.5±0.6 0.87±0.52 18.2±6.8 1，771.9±20.3 64.0±1.8 PCOS 38 32.6±0.4 23.1±3.2 0.9±0.3＊＊ 1.32±0.49＊ 26.8±8.0＊ 1，375.0±19.4＊68.3±8.0

二、主要試劑和儀器

RNA的提取采用 Qiagen RNeasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，德國），RNA測定采用電泳儀和電泳槽（BIO－RAD，美國），TRANSILLUMINA70R，BINTA 2020D凝膠成像系統(tǒng)（北京華興科儀科技公司），實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒［TaKaRa Biotechnology（Dalian）Co.Ltd，日本］和逆轉(zhuǎn)錄儀（BIO－RAD T100TMThermal Cycle，美國），熒光定量 PCR采用 LightCycler（Roche Diagnostics，Mannheim，德國）和 Rotor Gene 3000system（Corbett，澳大利亞）。

三、方法

1.超排卵方案：根據(jù)文獻(xiàn)［3，13］，所有患者均采用長方案促排卵：在黃體中期開始給予促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH－a，Diphereline，Ipen，Pharma Biotech，法國），0.05mg／d 皮下注射，持續(xù)到14d，若測得血清雌二醇（E2）＜30pg／ml（109.80pmol／L）、LH＜5IU／L，則可以確定已達(dá)到降調(diào)節(jié)的理想狀態(tài)，此時再給予重組人促性腺激素 （rFSH，Gona－f，F(xiàn)ollitropin Alfa，Serono，瑞 士）（159.97～237.30IU／d）進(jìn)行啟動，陰道超聲示有2個以上卵泡直徑＞18mm，測血清E2＞300pg／ml（1，098pmol／L）并有1個主導(dǎo)卵泡時，當(dāng)晚9：00左右給予人絨毛膜促性腺激素（HCG，Profasi，Serono，瑞士）10，000IU 肌肉注射。36h后，陰道超聲引導(dǎo)下取卵。

2.CC的處理與分類：取出的卵丘－卵母細(xì)胞復(fù)合物（COCs）浸于IVF－3.0培養(yǎng)液（Qiagen，Hilden，德國）中，顯微鏡下用5ml注射器的細(xì)針將CC從鄰近的卵母細(xì)胞上進(jìn)行剝離，將每一個卵母細(xì)胞對應(yīng)的剝離下來的CC收集在一個盛有80μl Buffer裂解液（RNeasy Minikit，Qiagen，Hilden，德國）的微量離心管（Eppendorf）中。凍存于－80℃冰箱，實驗備用。選取成熟的MⅡ期卵母細(xì)胞對應(yīng)的卵丘顆粒細(xì)胞（CCMⅡ）共300個（PCOS－CCMⅡ＝148個，non－PCOS－CCMⅡ＝152個）樣品進(jìn)行分組，所有的實驗對象可以分為以下6 組：PCOS－CCMⅡ－1，CCMⅡ－2， CCMⅡ－3， Non－PCOS－CCMⅡ－1， CCMⅡ－2，CCMⅡ－3，每組大約45～55個CC樣品并保持統(tǒng)一。

3.RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)：RNA的提取按照試劑盒（RNeasy Minikit，Qiagen，德國）的說明進(jìn)行。將所提取的RNA馬上取4μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，符合測定標(biāo)準(zhǔn)后，從每組樣品中提取大約140～150ng RNA樣品加入到逆轉(zhuǎn)錄儀的10μl體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作按照PrimeScript RT regent kit（Perfect Real time）（TaKaRa，日本）的說明書進(jìn)行，溫度設(shè)置如下：37℃15min，85℃5s，4℃5min。

4.實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT－PCR）：引物序列根據(jù)Genebank上所查的序列，由上海生工公司合成。引物序列如下，目的基因：ANGPTL1forward，5’TGGGAGGTAACGAGATTCAGAG 3’，ANGPTL1reverse，5’GCTTCTTTTGCTTGCTGACAGT3’；ANGPTL2forward，5’GGCTCGCCAAG－AGAGAGTTCAT3’，ANGPTL2reverse，5’TTCATGTTGCGGCTCTCCTT3’；內(nèi)參基因：GAPDH forward，5’TGTTGCCATCAATGACCCCTT 3’，GAPDH reverse，5’CTCCACGACGTACTCAGCG3’。從逆轉(zhuǎn)錄過來的每份cDNA樣品中吸取2μl進(jìn)行10μl體系的擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)按照LightCycler（Roche Diagnostics，Mannheim，德國）和Rotor Gene 3，000system（Corbett，澳大利亞）說明書進(jìn)行：95℃預(yù)熱30s；循環(huán)溫度如下：95℃持續(xù)5s，60℃持續(xù)20s，在20℃時選擇熒光FAM／SYBER，持續(xù)40個循環(huán)；溶解曲線溫度：65℃持續(xù)15s?？傮w反應(yīng)持續(xù)大約1h，運算分析最終所得CT值。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

將qRT－PCR 所得的 CT 值按照公式 2－ΔΔCT［14］進(jìn)行運算，所得的值采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

一、CCMII中ANGPTL1mRNA的表達(dá)

PCOS和non－PCOS患者的CCMII中均有ANGPTL1mRNA的表達(dá)，且PCOS組中的表達(dá)量低于non－PCOS 組的表達(dá)量，即PCOS 組ANGPTL1mRNA的表達(dá)量約是 non－PCOS的（0.83±0.16）倍，ANGPTL1mRNA 在 non－PCOS患者的CCMII的表達(dá)是上調(diào)的，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1 ANGPTL1在PCOS患者的CCMII上表達(dá)

二、CCMII中ANGPTL2mRNA的表達(dá)

PCOS和non－PCOS患者的CCMII中均有ANGPTL2mRNA的表達(dá)，且PCOS組中的表達(dá)量高于non－PCOS組的表達(dá)量，即 PCOS 組ANGPTL2mRNA的表達(dá)量約是 non－PCOS的（1.99±0.23）倍，ANGPTL2mRNA 在PCOS患者的CCMII的表達(dá)是上調(diào)的，與non－PCOS相比，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（圖2）。

圖2 ANGPTL2在PCOS患者的CCMII上呈顯著性高表達(dá)

討 論

人類的卵泡發(fā)育是一個有序的復(fù)雜過程。在卵巢組織中，始基卵泡在激素的作用下開始募集生長，最終僅有一個優(yōu)勢卵泡得以排卵，達(dá)到成熟狀態(tài)，完成隨后的受精及胚胎發(fā)育。在此過程中，卵母細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子參與顆粒細(xì)胞的增長和延伸過程。CC中的某些基因的表達(dá)調(diào)控著卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂及胞核成熟［15］，這些基因大多與卵泡內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)如缺氧、營養(yǎng)供應(yīng)不足、細(xì)胞凋亡有關(guān)［16］。卵丘CC起源于壁層顆粒細(xì)胞（granulosa cell，GC）。在哺乳動物中，顆粒細(xì)胞與卵丘顆粒細(xì)胞，卵丘顆粒細(xì)胞與卵丘顆粒細(xì)胞，卵母細(xì)胞與卵丘顆粒細(xì)胞之間存在著廣泛的縫隙連接，因此卵母細(xì)胞與卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物（COCs）之間靠著豐富的縫隙連接進(jìn)行著豐富的信號交流，從而達(dá)到一個內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。同時也可以看出卵母細(xì)胞與CC之間有著最直接的聯(lián)系。因此，通過研究CC上基因的表達(dá)特點來間接反映卵母細(xì)胞的發(fā)育特點。選擇CC入組研究的另一個原因是比起GC，CC的同源性較高，研究所用的GC經(jīng)?；煊邪准?xì)胞、淋巴細(xì)胞及其他膜層細(xì)胞的污染［13］。組織及細(xì)胞的同源性對于控制實驗對象的一致性是十分重要的。而且其他因素如：卵母細(xì)胞均為體內(nèi)成熟，均用rFSH，且PCOS患者（1，375.0±19.4IU）低于non－PCOS（1，771.9±20.3IU）患者，以防卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）。

PCOS導(dǎo)致的高雄激素血癥、高胰島素血癥及許多與血管發(fā)生密切相關(guān)的細(xì)胞因子的改變，嚴(yán)重擾亂了卵巢內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。PCOS患者紊亂的卵丘細(xì)胞－卵母細(xì)胞信號降低了卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能［17］。PCOS嚴(yán)重影響了育齡婦女的生活質(zhì)量，其肥胖及胰島素代謝異常的異質(zhì)性表現(xiàn)，亦是代謝綜合征的臨床表現(xiàn)，均有可能導(dǎo)致2型糖尿病和冠狀動脈血管性疾病。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸從分子層面入手，展開對PCOS的相關(guān)基因的研究。如PCOS患者的CC上表達(dá)的基因比non－PCOS的差異性校大，具體說來，PCOS患者的CC上異常表達(dá)最明顯的是許多生長因子類的基因，包括：表皮生長因子類似物，如表皮生長因子受體（EGFR）、表皮調(diào)節(jié)素（EREG）、雙調(diào)蛋白（AREG）和胰島素樣生長因子受體1和2（IGF－1R、IGF－2R），它們參與卵母細(xì)胞的成熟過程。在PCOS患者的CC上，與類固醇代謝有關(guān)的基因下調(diào)，同時還發(fā)現(xiàn)在PCOS患者中，轉(zhuǎn)錄生長因子受體及孕激素受體兩條信號途徑的異常調(diào)節(jié)［18］。有研究發(fā)現(xiàn)，在Bmp15－1－和Gdf9＋／－ 雙重基因突變小鼠的 CC中，膽固醇合成過程中酶的轉(zhuǎn)錄水平下降，嚴(yán)重影響了排卵前CC中的膽固醇代謝及糖酵解過程［19］。

卵泡的發(fā)育過程離不開大量血管的發(fā)生來提供充足的營養(yǎng)。血管生成素樣蛋白（angiopoietinlike proteins，ANGPTLs）與血管的發(fā)生密切相關(guān)。ANGPTLs包含有7個家族成員，ANGPTL1～7，由7個同名的基因編碼而成。ANGPTLs結(jié)構(gòu)上與血管生成素（angiopoietins，ANGPTs）高度同源，具有一個卷曲－卷曲樣區(qū)域（coiled－coiled district，CCD）和一個受體結(jié)合區(qū)域（fibrinogen－like district，F(xiàn)LD）［7，20，21］。由于ANGPTLs既 不 與 TIE1結(jié)合，也不與TIE2結(jié)合，因此被譽(yù)為孤立配體，只是結(jié)構(gòu)與功能上和ANGPTs高度同源，所以被稱為ANGPTLs或血管生成素相關(guān)蛋白（angiopoietin related proteins，ARP）［9］。有研究［22］顯示，ANGPTLs的活性不僅僅局限于脈管系統(tǒng)，同時也體現(xiàn)在其他組織中。有研究顯示，ANGPTL1、2在小雞胚胎移植前的子宮中高表達(dá)，證明了其參與了細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和血管發(fā)生過程。先前的關(guān)于ANGPTL1、2的研究較多地僅關(guān)注于其血管發(fā)生作用，如ANGPTL1、2在內(nèi)皮細(xì)胞表面通過未知受體來調(diào)節(jié)血管發(fā)生，具體是促進(jìn)還是抑制血管生成，主要取決于所處的周圍的環(huán)境而定［7］，并且二者可能是通過PI3－K／Akt信號途徑參與斑馬魚的胚胎發(fā)生過程［8，9］。目前就ANGPTLs在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的報道較少見。近年來，關(guān)于ANGPTL2在脂質(zhì)代謝方面的研究逐漸增多。在脂肪組織中，AN－GPTL2能夠介導(dǎo)慢性脂肪組織炎癥的發(fā)生，促進(jìn)肥胖相關(guān)的胰島素抵抗［23］。然而也有研究恰恰相反，ANGPTL2喂養(yǎng)小鼠的血漿中，血糖、胰島素、甘油三酯（TG）水平下降，說明了ANGPTL2在2型糖尿病不同時期發(fā)揮的不同作用［24］。本研究結(jié)果顯示，ANGPTL2在PCOS患者的CCs上高表達(dá)，其表達(dá)量約是non－PCOS患者的1.99倍（P＜0.05），提示ANGPTL2可能參與了PCOS致病的發(fā)生。雖然實時熒光定量的比值未＞2，但差異性是存在的。ANGPTL1在PCOS患者的CCs上低表達(dá)，但差異也無統(tǒng)計學(xué)意義，提示ANGPTL1的表達(dá)可能與PCOS這種疾病狀態(tài)無關(guān)。造成ANGPTL1、2的這種的表達(dá)的差異也有可能是本實驗中兩組患者的特異性差異。但兩組體重指數(shù)（BMI）比較無統(tǒng)計學(xué)意義，所以需要大量的實驗來驗證ANGPTL1、2與PCOS這種疾病的確切相關(guān)性。但是比較明確的一點是，相比ANGPTL1，ANGPTL2與PCOS卵母細(xì)胞的發(fā)育有著更緊密的相關(guān)性，其可能參與了PCOS的致病過程，引起卵巢內(nèi)及其周圍脂質(zhì)代謝的異常，從而影響卵泡的正常發(fā)育。

PCOS的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，由于其病因不清楚，所以目前仍缺乏理想的治療方法。本實驗通過研究ANGPTL1、2在PCOS患者CC上的表達(dá)，探討ANGPTLs與PCOS的相關(guān)性，不僅有助于深入理解PCOS的發(fā)病機(jī)制，同時也為PCOS的治療提供新的思路和藥物治療的靶點。

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