呂文立 朱忠才 范明勝

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院·哈爾濱 150036）

本研究是益氣通下法對急性化膿性腹膜炎炎癥因子變化的實驗性研究的一部分。通過盲腸結扎法建立大鼠急性腹膜炎動物模型，分別觀察在不同階段炎癥因子及的變化情況，意在探討建立一種簡便、易行、效果穩(wěn)定、便于獲取實驗數(shù)據(jù)的實驗方法，為實驗研究提供理想的動物實驗模型。

1 材料與方法

1.1 動物分組

選用體重180～200g的健康Wistar大鼠50只，雌雄各半，由吉林大學實驗動物中心(動物飼養(yǎng)合格證號ID200907028)提供。在標養(yǎng)條件下喂養(yǎng)觀察一周后,大鼠隨機分為空白組10只和模型組40只，采血時第一次分別從各組中隨機抽取8只采血。第二次及以后隨機從模型組中抽取8只采血。

1.2 腹膜炎模型制備

實驗前禁食12h，禁水6h。10%水合氯醛(0.33mL/100g體重)腹腔注射麻醉，麻醉顯效后,取下腹部正中切口，長約2cm，輕緩提出盲腸，在距盲腸游離末端1.0cm處用1號絲線全層結扎(盲腸末端腸內容物均勻,中等充盈)后，回納腸管，分兩層關腹，等待蘇醒。造模后自由進食飲水。

2 實驗方法

2.1 標本采集

分別在模型建立后第1、2、4、6天采血，10%水合氯醛（0.33mL/100g體重)腹腔注射麻醉，麻醉顯效后,下腹部正中切口，長約5cm，輕緩提出小腸及其他腹腔內容物，剝離并暴露腹主動脈，采血3ml，以4000轉∕分低溫（4℃)離心15分鐘取血清，置于-80℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 標本檢測

TNF-a，IL-6，TNF-aR濃度測定采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量檢測TNF-a，IL-6，TNF-aR的水平，ELISA法測定以上指標，嚴格按照說明書進行操作。

2.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件包進行統(tǒng)計處理，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，以P＜0.05為差異有顯著性，或以P＜0.01為差異有極顯著性。

2.4 實驗結果

2.4.1 一般情況 造模后所有動物蘇醒后均表現(xiàn)為精神萎糜，行動減少、遲緩，拒食、攝水量驟減，精神倦怠，蜷縮少動，反應遲鈍；12小時后個別病情嚴重者出現(xiàn)寒顫、毛發(fā)直立。造模24小時后，癥狀輕的動物開始少量進食,攝水量見增加，活動量增加，蜷縮少動者減少，極個別有嗜睡癥狀；48小時后模型動物均見明顯消瘦，有個別出現(xiàn)毛發(fā)直立，但活動量均增加；72小時后，大鼠上述癥狀明顯減輕，狀態(tài)較活躍。所有模型均無扭體現(xiàn)象發(fā)生，符合急性化膿性腹膜炎時靜臥少動以減輕疼痛的特點。

2.4.2 各階段模型大鼠血清TNF-a，IL-6，TNF-aR的水平變化

2.4.2.1 TNF-a水平變化情況(見表1）

表1 TNF-a的變化（單位：pg/ml,）

表1 TNF-a的變化（單位：pg/ml,）

組別 例數(shù)（只） 造模后24小時(第1天)造模后48小時(第2天)造模后96小時(第4天)造模后144小時(第6天)空白組 8 83.84±78.07 -- -- --模型組 每次8 358.11±60.50 330.53±49.43 289.06±43.03 261.60±19.53

造模24小時后，模型組與空白對照組相比，P＜0.01，有極顯著性差異，證實造模成功。造模后48小時組與24小時組，96小時組與48小時組,144小時組與96小時組相比，P＞0.05，均無顯著性差異。

2.4.2.2 IL-6水平變化情況(見表2)

表2 IL-6的變化（單位：pg/ml,）

表2 IL-6的變化（單位：pg/ml,）

組別 例數(shù)（只） 造模后24小時(第1天) 造模后48小時(第2天) 造模后96小時(第4天) 造模后144小時(第6天)空白組 8 378.63±113.31 -- -- --模型組 每次8 124.67±48.76 122.48±47.53 141.42±111.45 295.62±74.44

造模24小時后，模型組與空白對照組相比，P＜0.01，有極顯著性差異；造模后48小時組與24小時組，96小時組與48小時組相比,P＞0.05，均無顯著性差異；144小時組與96小時組相比,P＜0.01，有極顯著性差異。IL-6水平結果先降后升，與相關資料不符，原因還需進一步研究。

2.4.2.3 TNF-aR水平變化情況(見表3)

表3 TNF-aR的變化（單位：ng/ml,）

表3 TNF-aR的變化（單位：ng/ml,）

組別 例數(shù)（只） 造模后24小時(第1天) 造模后48小時(第2天) 造模后96小時(第4天) 造模后144小時(第6天)空白組 8 8.10±0.97 -- -- --模型組 每次8 5.44±1.45 5.61±0.65 6.12±0.39 6.54±0.32

造模24小時后，模型組與空白對照組相比，P＜0.01，有極顯著性差異；造模后48小時組與24小時組,96小時組與48小時組相比,P＞0.05，均無顯著性差異；144小時組與96小時組相比,P＜0.05，有顯著性差異。

3 討論

目前，對實驗性腹膜炎的研究大多采用細菌性腹膜炎，常用的造模方法有很多：向腹腔內注射純培養(yǎng)的菌液[1-3]，手術損傷盲腸[4]，向腹腔注射糞便混合物[5]和盲腸結扎法等。第一種在細菌誘發(fā)腹膜炎的動物模型方面各家報道注菌量存在著很大差異，不同佐劑的使用可表現(xiàn)出不同作用，也可表現(xiàn)出保護作用[6]。第二種模型因手術創(chuàng)傷和腸內容物的急性進入腹腔，快速形成細菌性腹膜炎和化學性腹膜炎，使炎癥反應過于急速和嚴重，模型動物的死亡控制困難，增加實驗難度。準確的控制腹膜炎的程度，在研究中難以保持實驗條件的齊同性、重復性與可比性，是本研究的造模難點之一。

本研究采用盲腸結扎法致大鼠急性腹膜炎，觀察腹膜炎的發(fā)生情況，所有動物采血時剝腹探查可見：1～3天可見結扎處壞死、滲出、色黑；3～5天逐漸形成粘連包裹。腹膜、大網(wǎng)膜充血水腫，伴腸管脹氣，肝、脾、腸管等臟器表面，可見有少量膿性纖維性滲出物附著，腹腔滲液混濁，伴有臭味。6-7天后炎癥情況逐漸減輕，膿性滲出減少，腸壁及腹膜充血減輕，小鼠活動性明顯改善。本模型的可控性在于結扎長度和結扎部位腸內容充盈度的控制。距末端1.0厘米結扎、充盈度中等時所形成的炎癥反應基本可自行控制，死亡率2-5%（7天內）；距末端1.5厘米結扎、充盈度中等者炎癥反應較重，死亡率2～20%（7天內）；據(jù)末端2.0厘米結扎者，死亡率五天內可達50%。同時炎癥反應程度與結扎時腸內容充盈度有著極大的關系。所以本實驗在保證結扎長度時，也應保證結扎部位充盈度的均一性，才能控制模型炎癥反應的均一性。本實驗研究結果證實，盲腸結扎的造模方法，使實驗模型與臨床過程更加一致，基本符合急性壞疽性闌尾炎合并腹膜炎的病理演變過程。采用盲腸結扎法有著手術創(chuàng)傷小、簡便易行、炎癥反應較強烈，實驗條件易于控制、齊同性、重復性較好等優(yōu)點。

大鼠在造模24小時后，模型組TNF-a水平相比空白組明顯升高，說明炎癥反應強烈，大鼠出現(xiàn)了嚴重的全身炎癥反應現(xiàn)象，細胞因子、炎癥介質的表達增高。在不同炎癥反應階段，TNF-a水平初期劇烈，后期一直平穩(wěn)。模型組TNF-aR水平初期相比空白組明顯降低,說明炎癥因子反應初期是以促進炎癥反應為主，抑制炎癥反應在后期才明顯增強，這很好地調控了炎癥反應進程。白細胞介素-6（IL-6）在本實驗中測得的數(shù)據(jù)是在炎癥反應初期與空白組相比較具有極顯著差異性，但數(shù)值卻與相關資料相反：炎癥反應初期比空白組明顯降低，中期上升平穩(wěn)，后期上升明顯。具體原因有待于作進一步研究。

本實驗中，從大鼠TNF-a，IL-6，TNF-aR的水平的明顯變化上可以得出：模型動物的炎癥反應在24小時至48小時最為明顯。所以，我們認為盲腸結扎法制造腹膜炎模型不僅是腹膜炎實驗研究的理想模型，而且對嚴重腹腔感染所致全身性炎癥反應綜合征和多臟器功能衰竭及重癥感染休克的研究也將提供一個有益的方法。不同階段炎癥因子的表達為治療急腹癥提供了理論基礎,為臨床藥物治療，促進康復，提供系統(tǒng)的實驗資料。同時,在實驗中的分組方法節(jié)省了動物資源與成本，為其他類似實驗做預實驗提供了新方法；保證了樣本數(shù)量，為有意義的統(tǒng)計處理打好了基礎；實驗中的采血方法能很好地預防溶血，保證了ELISA檢測的有效濃度。

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