謝家楠，郭建軍，金道超

(貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴陽 550025)

RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記)是一種基于PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)建立的較為傳統(tǒng)的分子標(biāo)記技術(shù)，由William 等20 世紀(jì)90年代提出(曹天文等，2009)。由于其具有技術(shù)簡(jiǎn)單、對(duì)DNA 純度要求較寬松、不需要任何分子遺傳背景、可用引物多等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于昆蟲遺傳多樣性檢測(cè)、基因定位、品系鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建和系統(tǒng)學(xué)等諸多領(lǐng)域(李東偉等，2010)。

白背飛虱Sogatella furcifera (Horváth)屬半翅目Hemiptera 飛虱科 Delphacidae (葛仲麟等，1984)，是廣布性重要水稻害蟲(秦厚國和葉正襄，2003)。自20 世紀(jì)50年代后期水稻種植制度改制以來，白背飛虱危害逐年擴(kuò)大，特別在近年因其暴發(fā)為害造成水稻大量減產(chǎn)甚至絕收的情況屢見不鮮(趙悅，2011)。在此背景下，展開了白背飛虱的廣泛研究(胡國文和劉芹軒，1981;馬巨法等，1996;程遐年等，2003;沈君輝等，2003)，如對(duì)白背飛虱蟲源研究表明廣西東北部早前遷入蟲源主要來自越南北部、海南、廣西西南及南部稻區(qū)(齊會(huì)會(huì)等，2011)。分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于白背飛虱研究成果較少，僅見于Liu 等(2010)采用ISSR (inter-simple sequence repeat)標(biāo)記開展云南稻區(qū)不同地理種群白背飛虱遺傳多樣性研究，對(duì)白背飛虱RAPD 及其PCR 體系系統(tǒng)優(yōu)化研究尚未見報(bào)道。

本研究采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)白背飛虱RAPD-PCR 體系進(jìn)行了優(yōu)化研究，分析了Mg2+濃度、Taq DNA 聚合酶量、dNTPs 濃度、模板DNA 量和Primers 濃度對(duì)白背飛虱RAPD-PCR 體系的影響，獲得了白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)的最優(yōu)體系，為白背飛虱的遺傳多樣性分析和分子生態(tài)學(xué)研究提供了有益借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣本:白背飛虱成蟲，采自2013年6月貴州省花溪區(qū)稻田，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)去寄生和饑餓處理。

引物:摘選近年相關(guān)研究中發(fā)表的隨機(jī)引物序列，委托上海生物工程有限公司合成，經(jīng)初步篩選，獲得10 條引物進(jìn)行本研究。

試劑:dNTPs、Taq DNA 聚合酶、10× PCR buffer、MgCl2等為寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 基因組DNA 提取

白背飛虱基因組DNA 提取采用SDS 法(王桂榮等，2001)并略加修改。BIO-RAD SmartSpec plus 核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA 濃度和質(zhì)量?；蚪MDNA-20℃保存。

1.3 RAPD-PCR 體系正交設(shè)計(jì)

為獲得白背飛虱最優(yōu)RAPD-PCR 反應(yīng)體系，對(duì)Mg2+濃度、Taq DNA 聚合酶量、dNTPs 濃度、模板DNA 量和Primer 濃度5個(gè)因素4個(gè)水平選用L16(45)正交優(yōu)化表做正交優(yōu)化試驗(yàn) (表1、表2)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。反應(yīng)體系包括上述5個(gè)成分外，添加2μL的10× PCR Buffer (10 mmol/L Tris-HCl;50 mmol/L KCl)，最后ddH2O 補(bǔ)充至20μL。

1.4 RAPD-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)

PCR 反應(yīng)在iCycler Thermal Cycler (BIO-RAD)PCR 儀上進(jìn)行，參數(shù)為:94℃變性4 min;94℃變性30 s，退火60 s，72℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠(含GoldView I 核酸染料)電泳檢測(cè)，UNIVERSAL HOOD‖(BIO-RAD)凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.5 引物退火溫度及反應(yīng)循環(huán)篩選

正交優(yōu)化試驗(yàn)建立白背飛虱RAPD-PCR 體系，RAPD 引物以Tm 值為基礎(chǔ)浮動(dòng)5℃進(jìn)行退火溫度篩選，以條帶豐富、穩(wěn)定為優(yōu)。以35、40、45 次3個(gè)梯度進(jìn)行RAPD-PCR 反應(yīng)循環(huán)次數(shù)篩選，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 直觀分析法評(píng)分

分析白背飛虱RAPD-PCR 正交試驗(yàn)產(chǎn)物電泳圖(圖1)，依據(jù)條帶豐富度、清晰度及背景干擾強(qiáng)弱做直觀分析。泳道條帶數(shù)量多、清晰度高、背景干擾低的PCR 產(chǎn)物記分最高，記16，相反記分最低，記1。圖1 自左至右結(jié)果記分依次記1、9、5、3、11、6、14、8、15、13、2、7、16、12、10、4。16個(gè)處理結(jié)果取3 次重復(fù)試驗(yàn)記分平均值。

表1 白背飛虱RAPD-PCR 體系因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of RAPD-PCR reaction of Sogatella furcifera

表2 白背飛虱RAPD-PCR 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表［L16(45)］Table 2 Orthogonal design for RAPD-PCR reaction of Sogatella furcifera

圖1 白背飛虱RAPD-PCR 正交試驗(yàn)產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Sogatella furcifera electrophoresis map of RAPD-PCR products of the orthogonal tests

2.2 RAPD-PCR 反應(yīng)影響因素分析

采用正交設(shè)計(jì)助手II 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，F(xiàn) 比值表明:白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)5個(gè)因素影響程度不同:Primer 濃度＞Mg2+濃度＞dNTPs 濃度＞模板DNA 量＞Taq DNA 聚合酶量。

2.2.1 Mg2+濃度對(duì)白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)的影響

白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)Mg2+濃度因素指標(biāo)值曲線表明(圖2):Mg2+濃度由1.5 mmol/L至1.8 mmol/L、2.1 mmol/L 至2.4 mmol/L 變化，因素指標(biāo)值增大;1.8 mmol/L 至2.1 mmol/L，因素指標(biāo)值減小。表明，白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)Mg2+濃度2.4 mmol/L 時(shí)最優(yōu)。

2.2.2 dNTPs 濃度對(duì)白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)的影響

白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)dNTPs 濃度因素指標(biāo)值曲線表明(圖2):dNTPs 濃度由0.15 mmol/L至0.3 mmol/L 變化，因素指標(biāo)值降低。白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)dNTPs 最優(yōu)濃度為0.15 mmol/L。

2.2.3 Primer 濃度對(duì)白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)的影響

白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)Primer 濃度因素指標(biāo)值曲線表明(圖2):Primers 濃度由0.1μmol/L至0.7μmol/L 變化，因素指標(biāo)值增大;白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)引物最優(yōu)濃度為0.7μmol/L。

圖2 白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)因素指標(biāo)曲線Fig.2 The RAPD-PCR factor index curve map of Sogatella furcifera

2.2.4 Taq DNA 聚合酶量對(duì)白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)的影響

白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)Taq DNA 聚合酶因素指標(biāo)值曲線表明(圖2):Taq DNA 聚合酶量由0.6 U 至0.8、1.0 U 至1.2 U 變化，因素指標(biāo)值增大;0.8 U 至1.0 U，因素指標(biāo)值減小。白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)Taq DNA 聚合酶量0.8 U 時(shí)最優(yōu)。

2.2.5 模板DNA 量對(duì)白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)的影響

白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)模板DNA 因素指標(biāo)值曲線表明(圖2):模板DNA 量由10 ng 至30 ng，因素指標(biāo)值增大;30 ng 至70 ng，因素指標(biāo)值減小。白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)模板DNA量為30 ng 時(shí)最優(yōu)。

2.3 退火溫度對(duì)白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)的影響

合適的退火溫度有利于RAPD-PCR 反應(yīng)。篩選的10 條引物，做退火溫度梯度篩選(圖3)，獲得各引物的最優(yōu)退火溫度，位于35-39℃間(表3)。

表3 白背飛虱RAPD-PCR 引物信息Table 3 The primer information of RAPD-PCR for Sogatella furcifera

圖3 引物P-2、P-10、P-11、P-24 退火溫度梯度篩選(自左向右)Fig.3 The results of RAPD-PCR at different annealing temperatures with primer P-2、P-10、P-11、P-24 (from left to right)

2.4 循環(huán)次數(shù)對(duì)白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)的影響

白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)循環(huán)次數(shù)篩選試驗(yàn)設(shè)置了35、40、45 次循環(huán)3個(gè)梯度，綜合條帶的豐富度及泳道彌散情況表明(圖4)，40 次循環(huán)為白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)最優(yōu)循環(huán)次數(shù)。

圖4 白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)循環(huán)次數(shù)篩選Fig.4 The results of different RAPD-PCR cycles

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果揭示Mg2+、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA 模板和Primer 因素綜合影響PCR 反應(yīng)產(chǎn)物，各影響因素間存在相互作用。正交設(shè)計(jì)優(yōu)化法以PCR 體系各因素綜合作用為研究對(duì)象，相對(duì)單因素分別優(yōu)化法，正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟，降低了試驗(yàn)成本，縮減了試驗(yàn)周期，獲得的最優(yōu)因素組合更符合試驗(yàn)實(shí)際情況(朱英等，2012)。

Mg2+作為PCR 反應(yīng)中Taq DNA 聚合酶激活劑，濃度過低降低聚合酶的活性，導(dǎo)致PCR 產(chǎn)物量降低;濃度過高導(dǎo)致PCR 產(chǎn)物中非特異產(chǎn)物增加，在一定范圍內(nèi)的高濃度Mg2+才會(huì)有助于獲得足量的特異性PCR 產(chǎn)物。dNTPs 作為合成PCR 產(chǎn)物原料，濃度過低則PCR 反應(yīng)不完全，產(chǎn)物量降低;濃度過高影響Mg2+的作用，在滿足合成產(chǎn)物的情況下，低濃度的dNTPs 有助于PCR 反應(yīng)。模板DNA 濃度高低影響著與引物的結(jié)合幾率，過低或過高都會(huì)降低結(jié)合幾率，影響產(chǎn)物量(張楊等，2012)。本研究基于正交優(yōu)化設(shè)計(jì)對(duì)白背飛虱RAPD-PCR的5個(gè)因素進(jìn)行4 水平優(yōu)化，構(gòu)建了最優(yōu)體系，即:2μL 10×PCR Buffer (10 mmol/L Tris-HCl;50 mmol/L KCl)，2.4 mmol/L Mg2+，0.15 mmol/L dNTPs，0.7μmol/L 引物，0.8 U Taq DNA Polymerase (TAKARA)和30 ng 模板DNA，ddH2O 補(bǔ)充至20μL。這一結(jié)果與褐飛虱RAPD 研究采用的PCR 體系相近(關(guān)秀杰等，2004)，而與灰飛虱(萬由衷等，2001)和小綠葉蟬(付建玉等，2007)RAPD-PCR 體系存在不同，這可能與褐飛虱生物學(xué)及遺傳學(xué)特性更接近白背飛虱有關(guān);同時(shí)也表明物種間RAPD-PCR 并不完全相同，構(gòu)建優(yōu)化RAPD-PCR 體系是進(jìn)行物種RAPD 研究的基礎(chǔ)。

退火溫度對(duì)PCR 結(jié)果有較大影響(楊家強(qiáng)等，2012)，溫度過低會(huì)增加引物與DNA 模板的非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果中出現(xiàn)大量非特異性結(jié)合條帶;溫度過高會(huì)降低引物與DNA 模板的特異性結(jié)合，導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果中特異性結(jié)合條帶減少。本研究對(duì)10 條白背飛虱RAPD-PCR 引物做退火溫度梯度篩選，獲得了各引物最優(yōu)退火溫度。各引物最優(yōu)退火溫度不盡相同，在35-39℃間。循環(huán)次數(shù)對(duì)RAPD-PCR 反應(yīng)結(jié)果有一定的影響，較少的循環(huán)次數(shù)會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物量偏少，目的條帶檢測(cè)困難;較多的循環(huán)次數(shù)會(huì)導(dǎo)致非特異產(chǎn)物的增加，導(dǎo)致泳道彌散嚴(yán)重。研究顯示40 次循環(huán)為白背飛虱RAPD-PCR 反應(yīng)最優(yōu)循環(huán)次數(shù)。

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