彭 威，鄭薇薇，彭 濤，吳方玉，張宏宇

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆蟲資源利用與害蟲可持續(xù)治理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，城市與園藝?yán)ハx研究所，武漢 430070)

桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis (Hendel)俗稱果蛆，又名東方果實(shí)蠅(Oriental fruit fly)，屬雙翅目 Diptera、實(shí)蠅科 Tephritidae、果實(shí)蠅 屬Bactrocera Macquart，是一種能導(dǎo)致果蔬業(yè)、花卉業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的毀滅性害蟲，在我國尤以對番石榴、芒果、柑桔、沙田柚等危害最重(韓日疇等，2005)，由于其食性雜、寄主范圍廣、繁殖力強(qiáng)、傳播快、防治困難，被大多數(shù)國家和地區(qū)列為水果―頭號殺手(季清娥等，2007)。Rab 蛋白為一類進(jìn)化上保守的GTP 結(jié)合蛋白，是質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)闹匾{(diào)控因子(Salminen et al.，1987)，屬GTP結(jié)合蛋白Ras 超家族的成員(Wennerberg et al.，2005)。Rab 蛋白通常作為活性和非活性狀態(tài)循環(huán)的分子開關(guān)，以時空靈敏的方式整合質(zhì)膜運(yùn)輸和細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)(Bucci et al.，2006)。盡管這類蛋白分子量小，只有20-25 kDa，結(jié)構(gòu)分析顯示它們具有多個反應(yīng)表面，通過這些反應(yīng)表面參與調(diào)節(jié)分子和下游效應(yīng)物，從而發(fā)揮功能(Chen et al.，2003)。Rab 蛋白廣泛參與了不同的細(xì)胞功能，包括質(zhì)膜融合和分裂、細(xì)胞內(nèi)吞作用、胞吐作用、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架運(yùn)輸。Rab 蛋白作為囊泡運(yùn)輸?shù)闹匾{(diào)節(jié)因子，在囊泡的出泡形成、選擇、粘附、運(yùn)動、錨定、融合等過程中起重要作用(Pfeffer et al.，2004)。目前發(fā)現(xiàn)，在裂殖酵母中含有7個Rab 蛋白，芽殖酵母編碼11個Rab 蛋白，線蟲、果蠅分別有29 種和33 種Rab 蛋白，擬南芥基因組編碼57 種Rab 蛋白，在人類Homo sapiens 已發(fā)現(xiàn)超過70 種Rab 蛋白和類Rab 蛋白。大約一半已知的Rab 蛋白研究表明，Rab 蛋白對信號傳遞，以及對細(xì)胞增殖和分化的控制很重要(Schwartz et al.，2008)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Rab 蛋白在發(fā)育過程中調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)。早期胚胎細(xì)胞的命運(yùn)受分泌信號蛋白如Hh、Wnt、TGFβ/Dpp的控制，信號濃度在空間和時間上的控制對正常發(fā)育來說至關(guān)重要，而受Rab 調(diào)控的胞內(nèi)運(yùn)輸調(diào)控著信號梯度和轉(zhuǎn)導(dǎo)(Seto et al.，2008)。此外，Rab 基因突變會影響細(xì)胞生長、壽命和其他生物學(xué)進(jìn)程(Schwartz et al.，2008)。

隨著對Rab 蛋白研究的深入，關(guān)于Rab 蛋白在昆蟲上的研究也有諸多報道。Uno 等對家蠶的Rab 蛋白進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Rab 蛋白會被家蠶腦部的蛋白激酶C 磷酸化 (Uno et al.，2004)。而Hiragaki 等人(2009)發(fā)現(xiàn)，磷酸化的Rab8 蛋白參與了昆蟲促前胸腺激素的分泌。對家蠶腦部的小分子GTP 結(jié)合蛋白Rab的研究發(fā)現(xiàn)，Rab7、Rab8 參與了家蠶腦部神經(jīng)元中的蛋白運(yùn)輸，而且它們可能在控制生理節(jié)律方面發(fā)揮了作用(Uno et al.，2010)。侯麗等人在對棉鈴蟲幼蟲到成蟲的發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，Rab32 參與了成蟲腸道的重建(Hou et al.，2011)。除此之外，目前，Rab 在昆蟲發(fā)育中的作用研究主要集中在果蠅。例如，在果蠅卵母細(xì)胞的發(fā)育過程中，Rab6 對微管細(xì)胞骨架的組織和定位是必須的(Coutelis et al.，2007)。而Rab30 蛋白在果蠅胚胎發(fā)育中的背部閉合、胚胎頭部對合、胸部閉合等過程是必須的(Thomas et al.，2009)。張軍等人對果蠅的Rab35 蛋白研究發(fā)現(xiàn)，Rab35 蛋白調(diào)節(jié)剛毛發(fā)育過程肌動蛋白纖絲的聚集，以及可培養(yǎng)細(xì)胞偽足的形成 (Zhang et al.，2010)。由此可見，Rab 家族基因參與了果蠅諸多重要的生命活動。基因表達(dá)是生物體中遺傳信息傳遞和實(shí)現(xiàn)的中間環(huán)節(jié)，而基因表達(dá)模式是基因表達(dá)調(diào)控的體現(xiàn)和結(jié)果，因此對全基因組基因表達(dá)模式的研究有助于揭示基因表達(dá)途徑及其調(diào)控規(guī)律，同時揭示生物體基因型和表型之間的特定關(guān)系(謝建明等，2003)。對桔小實(shí)蠅7個Rab 家族成員進(jìn)行鑒定并研究它們的基因表達(dá)模式能為揭示桔小實(shí)蠅Rab 家族基因功能提供基礎(chǔ)資料，同時對于篩選合適的基因功能研究靶標(biāo)基因具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

本研究中桔小實(shí)蠅來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)城市與園藝?yán)ハx研究所建立的實(shí)驗(yàn)室種群。飼養(yǎng)條件如下:溫度28℃，室內(nèi)的相對濕度保持在70%-80%，光周期設(shè)置為12 h ∶12 h (L ∶D)(Li et al.，2011)。

1.2 主要試劑及試劑盒

主要試劑、試劑盒:Gibco/BRL 公司(美國)的瓊脂糖、Sigma 公司(美國)的焦磷酸二乙酯(DEPC)、北京博邁德生物的2× Tag PCR Master Mix、上海申能博彩公司的Taq DNA 聚合酶、北京百泰克生物技術(shù)有限公司的高純總RNA 快速提取試劑盒、TaKaRa 公司(日本)的RT-PCR 第一鏈合成試劑盒、Bio-Rad 公司(美國)的iQTM SYBR ?Green Supermix 試劑盒。

1.3 生物信息學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

從轉(zhuǎn)錄組文庫中獲取得到桔小實(shí)蠅7個Rab基因的核苷酸序列信息(Zheng et al.，2012)。用DNAman 完成核苷酸序列編輯及氨基酸序列推導(dǎo)。通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)站點(diǎn)的BLASTX (http://www.nebi.nlm.nih.gov)查找各Rab 基因的高相似性序列。用ClustalX 2.0 對桔小實(shí)蠅Rab 家族基因氨基酸序列進(jìn)行多重比對，分析其保守性，揭示其活性位點(diǎn)。用MEGA5.0 軟件neighbor-joining 方法構(gòu)建Rab 蛋白進(jìn)化樹，根據(jù)bootstrap 方法用1000個重復(fù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4 桔小實(shí)蠅各發(fā)育階段總RNA的提取

取桔小實(shí)蠅二齡幼蟲、三齡幼蟲、預(yù)蛹、蛹、成蟲各10 頭，分別提取各組整蟲總RNA?？俁NA提取采用Bioteke 公司的高純總RNA 快速提取試劑盒(北京)，具體操作參照試劑盒說明書。

1.5 1st-Strand cDNA的合成、cDNA 質(zhì)量檢測

將各組樣本的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作參照TaKaRa 公司(日本)的RT-PCR 第一鏈合成試劑盒說明書。

取各樣本cDNA為模板，以桔小實(shí)蠅核糖體16S rRNA 設(shè)計引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后瓊脂糖凝膠檢測產(chǎn)物片段大小。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序信息設(shè)計Rab 家族基因的熒光引物，桔小實(shí)蠅16SrRNA 作為內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)中用到的引物名稱、堿基序列 (5' →3'):Rab1RTF (GCAGCGGAATACGCAAGTC)、Rab1RTR(TATCTCGGCAGCCATCGTC);Rab5RTF (AGCT CCTATGTACTATCGTGGTG)、Rab5RTR (TTTATG CAGTTCCTTGACCC);Rab7RTF (ACTTTCCTTTCG TGGTGCTCG)、Rab7RTR (GTACAGTTCAACCTCG GCTTC);Rab14RTF (TACTATCGTGGTGCTGCTG GTG)、Rab14RTR (GCAAACTCTTTGGCCTCTTCA);Rab18RTF (AAGTCAAGCCTCATTCGTCG)、Rab18 RTR (CTTCGGAATCTTTCAGCACC);Rab35RTF(G TAGACTTCAAGATACGCACCG)、Rab35RTR (CTA ACCATCGTCGTACATTCG);Rab40RTF (ACATGA GATATTATCCTGCCTTGA)、Rab40RTR (GCTTGA CACGTTTCCCTTCC);16s rRNARTF (CTCGTCCA ACCGTTCATACC)、16s rRNARTR (CTGACCTGCC CACTGAAGTT)。

實(shí)時熒光定量PCR 用iQTM SYBR ?Green Supermix (Bio-Rad，USA)試劑盒在Bio-RadiQ5 雙色實(shí)時熒光定量PCR 儀上進(jìn)行。每個樣品設(shè)三個重復(fù)。熒光定量PCR 結(jié)束后分析溶解曲線，以確保特異性擴(kuò)增。實(shí)時熒光定量PCR 結(jié)果由Opticon Monitor 軟 件2.03Version (MJ research，USA)量值2-ΔCt方法分析，以16S rRNA 表達(dá)量校正目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 桔小實(shí)蠅Rab 基因生物信息學(xué)分析

我們從桔小實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組文庫中鑒定得到了7個Rab 基因全長 cDNA 序列 (Rab1 Genbank accession number:KF 859977;Rab5 Genbank accession number:KF 859978;Rab7 Genbank accession number:KF 859979;Rab14 Genbank accession number:KF 859980;Rab18 Genbank accession number:KF 859981;Rab35 Genbank accession number:KF 859982;Rab40 Genbank accession number:KF859983)。

通過NCBI的BLASTX 查找到與桔小實(shí)蠅7個Rab 基因的氨基酸序列對應(yīng)的相似序列，相似性比對結(jié)果如表2 所示。結(jié)果顯示，除BdRab18 氨基酸序列與刺舌蠅Glossina morsitans Rab18的氨基酸序列相似度達(dá)到85%外，桔小實(shí)蠅其余Rab 基因的氨基酸序列均與黑腹果蠅D.melanogaster 所對應(yīng)的Rab 基因的氨基酸序列相似度最高，相似度最高達(dá)到96%，最低也到達(dá)85%。

表1 桔小實(shí)蠅7個Rab 基因的氨基酸序列同源比對結(jié)果Table 1 Identity of amino acid sequence for Bactrocera dorsalis Rab genes

對桔小實(shí)蠅7個Rab 基因氨基酸序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果如圖1 所示。氨基酸序列比對顯示這7個Rab 氨基酸序列存在部分保守序列。而這些區(qū)域構(gòu)成GTP/Mg2+結(jié)合位點(diǎn)和Rab 蛋白分子特征序列。其中，68 位F 和147-151 位GNKCD 構(gòu)成GTP 結(jié)合位點(diǎn)，38-44 位GDSGVGK 構(gòu)成Mg2+結(jié)合位點(diǎn)，64-68 位IGVDF、82-86KLQTW、94-97 位RFRSIT、100-104 位YYRGA、109-114位LVYDIT 均是Rab 蛋白特征序列。

2.2 桔小實(shí)蠅Rab 基因系統(tǒng)發(fā)育分析

對桔小實(shí)蠅7個Rab 基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2 所示。

圖1 桔小實(shí)蠅7個Rab 基因氨基酸序列多重比對結(jié)果Fig.1 Multiple alignment of amino acid sequences of 7 Rab genes for Bactrocera dorsalis

圖2 桔小實(shí)蠅7個Rab 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic analyses of 7 BdRab genes with other similar genes

桔小實(shí)蠅7個Rab 基因?qū)儆诓煌耐吹鞍?。結(jié)果顯示桔小實(shí)蠅7個Rab 基因與黑腹果蠅對應(yīng)的7個Rab 基因進(jìn)化距離最近?？偣卜譃槿笾?，BdRab1、BdRab35、BdRab40 同屬一支，分別與DmRab1、DmRab35、DmRab40 進(jìn)化距 離最近。BdRab5、BdRab14、BdRab18 同屬一支，分別與DmRab5、DmRab14、DmRab18 進(jìn)化距離最近。BdRab7 對應(yīng)DmRab7。

2.3 桔小實(shí)蠅Rab 基因表達(dá)模式分析

我們通過實(shí)時熒光定量PCR 檢測了桔小實(shí)蠅Rab 基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式(圖3)。

圖3 BdRab 在桔小實(shí)蠅生命周期各階段的表達(dá)模式Fig.3 The expression pattern of BdRab in the life cycle of Bactrocera dorsalis

由圖3 可知，BdRab1 在三齡和蛹期表達(dá)量最高，BdRab5 在成蟲期高表達(dá)，BdRab7 在預(yù)蛹期高表達(dá)，BdRab14、BdRab18 均在三齡幼蟲期表達(dá)量顯著上調(diào)，BdRab35 在三齡和蛹期大量表達(dá)，BdRab40 在三齡幼蟲和成蟲期大量表達(dá)，暗示各基因在桔小實(shí)蠅不同發(fā)育過程中發(fā)揮功能。三齡幼蟲是化蛹前的準(zhǔn)備階段，完全變態(tài)昆蟲蛹期進(jìn)行著劇烈的舊組織解離和新組織的發(fā)生，需要大量營養(yǎng)物質(zhì)和能量，化蛹前昆蟲大量取食并迅速生長，形態(tài)體積增大，為化蛹做好營養(yǎng)積累的準(zhǔn)備。表明BdRab14、BdRab18 可能參與化蛹的準(zhǔn)備活動。

3 結(jié)論與討論

我們對桔小實(shí)蠅Rab 基因的7個成員進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式研究。對桔小實(shí)蠅Rab家族成員基因進(jìn)行表達(dá)模式研究，發(fā)現(xiàn)各基因表達(dá)模式有差異，暗示各基因在桔小實(shí)蠅生長發(fā)育過程中發(fā)揮不同的功能作用。其中BdRab5 在成蟲期顯著表達(dá)，而其它階段的表達(dá)則處于極低水平，說明其可能參與了成蟲期的重要生命活動過程。Seto 等研究發(fā)現(xiàn)Rab5 在果蠅翅的發(fā)育中通過錨定Wnt 蛋白調(diào)節(jié)了Wnt 信號通路 (Seto et al.，2006)，這一報道則驗(yàn)證了BdRab5 可能參與成蟲重要生命活動的假設(shè)。小分子GTP 結(jié)合蛋白亞家族成員Rab7 在桔小實(shí)蠅幼蟲二齡蛻皮、三齡變態(tài)階段尤其是預(yù)蛹階段有顯著表達(dá)，而這些階段與桔小實(shí)蠅幼蟲的化蛹發(fā)育階段有時間上重合，Rab7 可能參與到該過程。Rab7 屬于小分子GTP 結(jié)合蛋白亞家族Rab 家族，該家族成員較多，人類Homo sapiens 身上已發(fā)現(xiàn)超過70 種Rab 蛋白和Rab樣蛋白，它們在生命活動中扮演多種重要角色，大約一半已知的Rab 蛋白研究表明，Rab 蛋白對信號傳遞，以及對細(xì)胞增殖和分化的控制很重要，Rab 蛋白的突變會影響細(xì)胞生長、壽命和其他生物學(xué)進(jìn)程 (Schwartz et al.，2008)。BdRab 14、BdRab 18 均在三齡幼蟲期顯著表達(dá)，在其它階段表達(dá)量都很低，而三齡幼蟲是化蛹前的準(zhǔn)備階段，完全變態(tài)昆蟲蛹期進(jìn)行著劇烈的舊組織解離和新組織的發(fā)生，需要大量營養(yǎng)物質(zhì)和能量，化蛹前昆蟲大量取食并迅速生長，形態(tài)體積增大，為化蛹做好營養(yǎng)積累的準(zhǔn)備。所以推測三者可能與化蛹的準(zhǔn)備活動有關(guān)。然而，目前有關(guān)Rab 基因在桔小實(shí)蠅化蛹準(zhǔn)備活動中的具體功能還未見報道，需要進(jìn)一步的研究。Rab 蛋白是一類小分子GTP結(jié)合蛋白，對囊泡運(yùn)輸和信號傳遞十分重要，對Rab 基因在桔小實(shí)蠅變態(tài)發(fā)育中表達(dá)模式的研究，不僅有助于闡明桔小實(shí)蠅變態(tài)發(fā)育的分子機(jī)制，而且可為桔小實(shí)蠅防治提供新思路和途徑。

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