陳澤斌, 夏振遠, 雷麗萍, 徐勝光, 王墨浪, 寸林江, 李啟

1昆明學院農(nóng)學院,云南省都市型休閑農(nóng)業(yè)工程技術研究中心,昆明,650214;

2云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院,昆明,650031;

3云南省煙草公司保山市公司,保山,678000

煙草內(nèi)生細菌種群特征分析

陳澤斌1, 夏振遠2, 雷麗萍2, 徐勝光1, 王墨浪3, 寸林江1, 李啟1

1昆明學院農(nóng)學院,云南省都市型休閑農(nóng)業(yè)工程技術研究中心,昆明,650214;

2云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院,昆明,650031;

3云南省煙草公司保山市公司,保山,678000

為探明煙草內(nèi)生細菌種群特征及其與煙草的關系,采用研磨組織稀釋分離法分離不同品種、不同生長期、不同器官的煙草內(nèi)生細菌,以各菌群出現(xiàn)與否為指標,用類平均法進行系統(tǒng)聚類分析,對內(nèi)生細菌的種類組成,分布特征進行了研究。結(jié)果表明,煙草內(nèi)生細菌種類組成存在品種差異、生長期差異和組織部位差異；優(yōu)勢菌群隨分離部位和生長時期的不同而變化。Bacillussp.和Rhizobiumsp.是4個品種煙草葉片共有的優(yōu)勢類群,從苗期到團棵期,內(nèi)生細菌的種類在增加,B.pumilus廣泛存在于成熟期煙草的根、莖、葉中,且為主要菌群。部分內(nèi)生細菌具有組織偏好性,Micrococcussp.和Staphylococcussp.對煙草的莖部具有偏好性,B.cereus對煙草葉片具有偏好性。研究結(jié)果為煙草有益內(nèi)生細菌的篩選奠定了基礎,并為內(nèi)生細菌在其它植物中的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

煙草; 內(nèi)生細菌; 種群; 特征分析

植物內(nèi)生細菌在與植物的長期進化過程中,與宿主相互選擇,相互影響,形成了一種復雜、特殊的關系,包括互惠共生關系以及無害的或有害的寄生關系,且兩種關系可以在一定的條件下相互轉(zhuǎn)化。內(nèi)生細菌的遺傳多樣性是由外部環(huán)境和宿主基因型等多種因素共同決定的[1]。植物內(nèi)生細菌是植物體內(nèi)的正常菌群,在宿主和環(huán)境的共同影響下形成了內(nèi)生細菌的不同種群[2]。因此內(nèi)生細菌在植株內(nèi)的種類和數(shù)量不是一成不變,而是各有特點。不同品種宿主、不同生長季節(jié)、不同部位,其內(nèi)生細菌的種群分布特征存在差異,這些差異在某種程度上也反映了宿主植物生長的外部環(huán)境狀況。

近幾年有關內(nèi)生細菌的研究主要集中在種群密度調(diào)查、種群多樣性分析、防病促生內(nèi)生細菌的篩選與應用,已有大量的文獻報道[3-5]。涉及的植物包括：番茄、花生、棉花、玉米、水稻等作物。而對我國重要經(jīng)濟作物煙草有關內(nèi)生細菌的研究鮮見報道,唯有馬冠華,肖崇光兩位學者針對煙草不同品種、不同栽培時期及不同組織的內(nèi)生細菌種群作了初步調(diào)查[6],為探明煙草內(nèi)生細菌種群特征及其與煙草的關系,筆者選取了云南省種植的4個煙草品種為試驗材料,對不同生長期根、莖、葉內(nèi)生細菌種群特征展開研究。揭示煙草不同品種、不同生長期、不同組織中內(nèi)生細菌的種類、多樣性及分布,探討了內(nèi)生細菌對宿主品種和組織的偏好性。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和處理

以云南省玉溪市世界煙草品種園中的云煙85,K326,紅花大金元（以下簡稱紅大）以及KRK26不同生長期的葉片,成熟期的根、莖為試驗材料。選擇生長性狀良好的健康植株采樣。樣品采集后裝于密封的采樣袋中,低溫保鮮,24 h之內(nèi)進行內(nèi)生細菌的分離。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

內(nèi)生細菌分離和培養(yǎng)用NA[7]、液體培養(yǎng)用LB[7],基因組DNA提取,16S rDNA片段擴增所用的各種酶、Marker、dNTPs,Buffer等試劑為寶生物工程（大連）產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 內(nèi)生細菌的分離

按文獻[8]的方法。

1.4 菌落計數(shù)

選取合適的平板（每皿30～300個菌落）對菌落計數(shù),并計算每克植株鮮重的菌落形成單位數(shù)（Colony-Forming Units Per Gram Fresh Weight）cfu/g.fw=（菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) × 分離用水量）／（涂板用水量 × 分離組織重量）。

1.5 內(nèi)生細菌的鑒定

按文獻[8]的方法。

1.6 內(nèi)生細菌群落多樣性分析

將內(nèi)生細菌的種類作為數(shù)量測度,用DPS軟件分析煙草內(nèi)生細菌的香農(nóng)多樣性指數(shù)Shannon -Wiener（H）[9]、均勻度指數(shù) Evenness（E）[9]。

1.7 內(nèi)生細菌在煙草植株內(nèi)的分布特征

以各菌群是否分離到為指標,組成“0-1”數(shù)據(jù)矩陣,將所得數(shù)據(jù)輸入DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),采用Watson距離為聚類尺度,以類平均法對數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析,得出各菌群的分布特征聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同煙草品種葉片內(nèi)生細菌種群特征分析

云煙85、KRK26、K326、紅大葉片內(nèi)生細菌的種類與所占比例見圖1（分離時期為苗期、團棵期、旺長期、成熟期）,云煙85中含量最高的三種類群為Pantoea agglomerans、Rhizobiumsp.、Bacillus pumilus,所占比例分別為20.40%、21.71%、19.20%。KRK26中含量最高的三種類群為B.pumilus、Rhizobiumsp.、B.cereus,所占比例分別為23.89%、33.81%、15.60%。紅大中含量最高的 三 種 類 群 為B.pumilus、Rhizobiumsp.、Pantoea agglomerans,所占比例分別為23.04%、27.41%、10.06%。K326中含量最高的三種類群為Pantoea agglomerans、B.cereus、Rhizobiumsp., 所 占 比例分別為29.09%、25.71%、12.90%。由此可見,Bacillussp.和Rhizobiumsp.是4個品種煙草葉片共有的優(yōu)勢類群,在4個品種煙草葉片中均有分布,含量在12.90%-33.81%間?？梢酝茢郆acillussp.和Rhizobiumsp.類群細菌廣泛存在于4個品種煙草葉片中,說明其對煙草組織的侵染力很強且具有廣譜性,能夠進入4個品種的植株中,其他優(yōu)勢類群的分布則因煙草品種而異。

以各菌群在各品種葉片中出現(xiàn)與否為指標,用類平均法對數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析,結(jié)果見圖2,當Watson聚類距離λ=0時,分為8個類群。類群1 包括B.pumilus、B.amyloliquefaciens、B.subtilis、B.megaterium、B.flexus、B.simplex、B.cereus、Micrococcussp.、Rhizobiumsp.、Sphingomonassp.、Pantoea agglomerans、Acinetobactersp.、Stenotrophomonassp.,它們普遍存在于4個品種煙草葉片中。類群2包括Microbacteriumsp.、Alcaligenes faecalis,少量（≤3.00%）存在于云煙85、KRK26、K326這三個品種葉片中。類群3僅有B.licheniformis,少量（≤0.06%）存在于KRK26和K326葉片中。類群4包括Staphylococcussp.,少量（≤0.26%）存在于云煙85和KRK26葉片中。類群5僅有Pseudomonassp.,少量（≤0.27%）存在于紅大和K326葉片中。類群6僅有Sporosarcinasp.,少量（0.37%）存在于KRK26葉片中。類群7僅有Bifissio spartinae,少量（≤0.33%）存在于KRK26和紅大葉片中,類群8僅有Naxibactersp.,少量（0.39%）存在于云煙85葉片中。由于類群2-8包括的種群均是少量存在于某個或某幾個煙草品種葉片中,數(shù)目極少,是稀有的種群,不能判斷它們是否具有品種?；?。

分析了不同品種煙草葉片內(nèi)生細菌的香農(nóng)多樣性指數(shù)Shannon-Wiener（H）、均勻度指數(shù)Evenness（E）（表1）。香農(nóng)多樣性指數(shù)由大到小依次為云煙85＞ 紅大 ＞ K326 ＞ KRK26,說明云煙85葉片中內(nèi)生細菌的多樣性最高。均勻度指數(shù)由大到小依次為紅大＞ 云煙85 ＞ K326 ＞ KRK26,說明紅大葉片中各內(nèi)生細菌菌群分布最均勻,KRK26中優(yōu)勢種最突出。

圖1 不同煙草品種葉內(nèi)生細菌種類組成分析Fig.1 Analysis of endophytic bacteria flora in leaf of different tobacco cultivars

圖2 不同煙草品種葉片內(nèi)生細菌菌群聚類分析Fig.2 Cluster analysis of endophytic bacteria flora in leaf of different tobacco cultivars

表1 不同品種煙草葉片內(nèi)生細菌多樣性指數(shù)Tab.1 Diversity index of endophytic bacteria in leaf of different tobacco cultivars

2.2 不同生長期葉內(nèi)生細菌種群特征分析

苗期、團棵期、旺長期、成熟期4個生長時期煙草葉片內(nèi)生細菌種類與所占比例見圖3（分離品種包括云煙85、KRK26、K326、紅大）,苗期葉片中含量最高的三種類群為B.pumilus、B.cereus、B.megaterium,所占比例分別為63.07%、11.48%、5.63%。團棵期中含量最高的三種類群為P.agglomerans、R.sp.、Acinetobactersp.,所占比例分別為21.84%、17.77%、17.00%。旺長期中含量最高的三種類群為P.agglomerans、B.cereus、B.megaterium, 所 占比例分別為33.45%、28.52%、11.25%。成熟期中含量最高的三種類群為Rhizobiumsp.、B.pumilus、B.cereus.,所占比例分別為32.49%、19.03%、16.59%。從苗期到團棵期,內(nèi)生細菌的種類在增加,團棵期除了未分離到苗期中少量存在的B.licheniformis和Bifissio spartinae外,相比苗期增加了Sporosarcinasp.、Sphingomonassp.、Alcaligenes faecalis、Pseudomonassp.、Stenotrophomonassp.5 個類群的細菌,到旺長期又降至11種,成熟期又新增了Microbacteriumsp.、Micrococcussp.兩種細菌。這表明不同生長期葉片內(nèi)生細菌種類存在差異,這可能與不同煙草生長期中的溫度、濕度關系密切。

不同生長期葉片內(nèi)生細菌各菌群系統(tǒng)聚類分析結(jié)果見圖4,當Watson聚類距離λ=0時,分為8個類群。類群1包括B.pumilus、B.amyloliquefaciens、B.subtilis、B.megaterium、B.flexus、B.cereus、Rhizobiumsp.、P.agglomerans、Acinetobactersp.。它們的共同特征是存在于煙草葉片的各個生長期中,為常住菌群[6]（Resident Flora）。類群2僅有B.licheniformis,其特征是少量（≤0.28%）存在于苗期和旺長期葉片中。類群3僅有Microbacteriumsp.、Micrococcussp,它們的共同特征是少量（≤4.15%）存在于煙草成熟期葉片中。類群4包括Sphingomonassp.、Stenotrophomonassp., 少 量（≤5.39%）存在于苗期和成熟期葉片中。類群5包括B.simplex.、Naxibactersp.。它們的共同特征是少量（≤3.54%）存在煙草的苗期和團棵期葉片中。類 群 6 包 括Sporosarcinasp.、Alcaligenes faecalis、Pseudomonassp.,它們少量（≤0.77%）存在于煙草團棵期葉片中。類群7僅有Bifissio spartinae,少量（2.90%）存在于苗期煙草葉片中,類群8包括Staphylococcussp.,少量（0.35%）存在于煙草旺長期葉片中。類群2-8的細菌只在某一特定生長期或某幾個生長期中存在,為暫居菌群（Transient Flora）。這可能與大多數(shù)內(nèi)生細菌屬于兼性內(nèi)生細菌有關[10]。

對不同生長期煙草葉片內(nèi)生細菌的多樣性進行了分析（表2）。香農(nóng)多樣性指數(shù)由大到小依次為團棵期 ＞ 成熟期 ＞ 旺長期 ＞ 苗期,說明團棵期葉片中內(nèi)生細菌的多樣性最高。均勻度指數(shù)由大到小依次為團棵期 ＞ 旺長期 ＞ 成熟期 ＞ 苗期,說明團棵期中各內(nèi)生細菌菌群分布最均勻,苗期優(yōu)勢種最突出。

圖3 不同生長期煙草葉內(nèi)生細菌種類組成分析Fig.3 Analysis of endophytic bacteria flora in leaf at different growing stages

圖4 不同生長期煙草葉內(nèi)生細菌菌群聚類分析Fig.4 Cluster analysis for endophytic bacteria flora in leaf at different growing stages of tobacco

表2 不同生長期煙草葉內(nèi)生細菌多樣性指數(shù)Tab.2 Diversity index of endophytic bacteria flora in leaf at different growing stages

2.3 成熟期根、莖、葉內(nèi)生細菌種群特征分析

成熟期煙草根、莖、葉內(nèi)生細菌種類與所占比例見圖5（分離品種包括云煙85、KRK26、K326、紅大。）,根部含量最高的三種類群為Rhizobiumsp.、B.megaterium、B.pumilus所占比例分別為45.46%、23.60%、21.90%。莖部含量最高的三種類群為B.pumilus、B.amyloliquefaciens、Staphylococcussp.,所占比例分別為26.56%、16.41%、13.09%。葉片中含量最高的三種類群為Rhizobiumsp.、B.pumilus、B.cereus,所占比例分別為32.49%、19.03%、16.59%。由此可見B.pumilus廣泛分布于成熟期煙草根、莖、葉中,且為主要菌群。

成熟期不同器官各菌群系統(tǒng)聚類分析結(jié)果見圖6,當Watson聚類距離λ=0時,分為6個類群。類 群 1包 括B.pumilus、B.amyloliquefaciens、B.subtilis、B.megaterium、Rhizobiumsp.、Acinetobactersp.,它們普遍存在于成熟期煙草的根、莖、葉中。類群 2包括B.flexus、Microbacteriumsp.、Micrococcussp.,只存在于莖和葉中。其中Micrococcussp.在莖中的含量達到11.33%,但在葉中的含量僅為0.89%。推測Micrococcussp.類群具有組織?；?對煙草的莖部具有偏好性。類群3僅有B.simplex,少量（≤8.01%）存在于根和莖中,而葉中未分離到。類群4包括B.cereus、P.agglomerans、Stenotrophomonassp.只存在于成熟期根和葉中。其中B.cereus在葉中的含量為16.59%,而在根部的含量僅為0.12%。推測B.cereus類群具有組織?；?對煙草葉片組織具有偏好性。類群5僅有Sphingomonassp.,少量（0.62%）存在于葉中。類群6包括Staphylococcussp.、Pseudomonassp.,它們只存在于莖中。其中Staphylococcussp.類群含量為13.09%,推測該屬細菌具有組織?；?對煙草莖部具有偏好性。

對成熟期根、莖、葉中內(nèi)生細菌多樣性進行了分析（表3）。香農(nóng)多樣性指數(shù)由大到小依次為莖 ＞葉 ＞ 根,說明莖中內(nèi)生細菌的多樣性最高。均勻度指數(shù)由大到小依次為莖 ＞ 葉 ＞ 根,說明莖中各內(nèi)生細菌菌群分布最均勻,根中優(yōu)勢種最突出。

圖5 成熟期煙草根、莖、葉內(nèi)生細菌種類組成分析Fig.5 Analysis of endophytic bacteria flora in different organs at maturing stage

圖6 成熟期煙草不同器官內(nèi)生細菌菌群聚類分析Fig.6 Cluster analysis of endophytic bacteria flora in different organs at maturing stage of tobacco

表3 成熟期煙草不同器官內(nèi)生細菌多樣性指數(shù)Tab.3 Diversity index of endophytic bacteria flora in different organs at maturing stage

3 結(jié)論與討論

對栽種在同一地區(qū)的4個品種煙草的內(nèi)生細菌種群差異進行了分析,發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌在煙草植株中的定殖具有普遍性、多樣性,某些內(nèi)生細菌對煙草植株的侵染具有選擇性。在分離到的所有煙草內(nèi)生細菌中以Bacillus屬細菌分布最廣,已鑒定出8個種,包括B.pumilus,B.amyloliquefaciens,B.licheniformis,B.subtilis,B.megaterium,B.flexus,B.simplex,B.cereus。目前Bacillus屬細菌已在番茄、花生、棉花、玉米、水稻等多種作物中作為優(yōu)勢類群多次被報道[3-5]。推測Bacillus屬細菌可以與絕大多數(shù)植物共生,相比其它種類的內(nèi)生細菌Bacillus屬細菌更具有生存競爭力,且宿主專一性最小,成為多種植物內(nèi)生細菌中的優(yōu)勢微生物。

不同品種煙草內(nèi)生細菌的種群的組成、分布特點各不相同,其中Bacillussp.和Rhizobiumsp.類群細菌普遍存在于紅大、K326、KRK26、云煙85四個生長期的葉片中,是4個品種煙草共有的優(yōu)勢類群,其他優(yōu)勢類群的分布則因煙草品種而異。這種差異可能與內(nèi)生細菌對宿主的侵染具有選擇性和特異性有關,某些內(nèi)生細菌需要尋找到具有特定基因型及表型的宿主才能夠成功侵染定殖。前人研究發(fā)現(xiàn)宿主植物的基因型能影響內(nèi)生細菌的菌群組成[11]。不同品種宿主的基因型不同,引起宿主具有不同的表型和生理特征,導致內(nèi)生細菌的生存環(huán)境條件不同,從而使得內(nèi)生細菌菌群呈現(xiàn)出差異。還有的學者認為,有的內(nèi)生細菌對宿主的基因型敏感,甚至在寄主種的水平上具有專一性[12]。鑒于此,可推斷不同宿主的遺傳背景能夠在內(nèi)生細菌的種群特征上得到體現(xiàn)[13-14],這一點需要在今后的研究中進一步驗證和討論。

隨著宿主生長期的演替,其群落組成呈現(xiàn)動態(tài)差異,內(nèi)生細菌的種類從苗期到成熟期一直在增加,這可能是由于生長時間的累積,不同內(nèi)生細菌在煙草中的定殖率增加,其次,隨著煙株的生長發(fā)育,煙株內(nèi)部的生理特征與外部表型特征發(fā)生了改變,從而導致內(nèi)生細菌種群特征和分布隨之發(fā)生了改變。

Carroll等[12]研究了法國和瑞士針葉樹上不同組織中的7種內(nèi)生真菌群落,發(fā)現(xiàn)葉柄和葉頂端一些內(nèi)生真菌種類明顯不同,因此提出了一些內(nèi)生真菌種類具有組織專一性的假說。本研究也發(fā)現(xiàn)某些煙草內(nèi)生細菌具有組織專化性,例如Micrococcussp.和Staphylococcussp.只在煙草的莖部分離得到,B.cereus只在煙草葉片中分離得到,推測它們分別對煙草莖部、葉片具有偏好性,這與Carroll假說是一致的。這可能是由于不同的內(nèi)生細菌對營養(yǎng)物質(zhì)的需求不同,而不同器官組織的生理狀態(tài)、化學物質(zhì)組成和含有的營養(yǎng)物質(zhì)不完全相同,從而造成了內(nèi)生細菌侵染、定殖和分布的差異性[10]。

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Characteristic analysis of endophytic bacteria population in tobacco

CHEN Zebin1,XIA Zhenyuan2,LEI Liping2,XU Shengguang1,WANG Molang3,CUN Linjiang1,LI Qi1
1 Agriculture College, Engineering Research Center for Urban Leisure Agriculture of Yunnan Province, Kunming University,Kunming 650214, China;
2 Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming 650031, China;
3 Yunnan Baoshan Tobacco Company, Baoshan 678000, China

Endophytic bacteria were isolated from tobacco by the method of grinding separation.The composition of endophytic bacteria population in different cultivars, different tissues and different growth stages were studied.Results showed that the composition and quantity of dominant bacterial community varied with changes of cultivars, growth stages and tissues.Bacillussp.andRhizobiumsp.were considered as dominant genera of endophytic bacteria in leaf from different tobacco cultivars.The endophytic bacteria flora in leaf increased from seedling stage to maturing stage.B.pumiluswere considered as dominant genera of endophytic bacteria in root, stem and leaf during maturing stage.Cluster analysis in which euclidean distance was taken as similarity measure using group average method showed that endophytic bacteria in tobacco had tissue specificity.Micrococcussp.andStaphylococcussp.had tissue specificity to stem whileBacillus cereushad tissue specificity to leaf.The study could help to lay foundation for screening beneficial endophytic bacteria and to provide references for using in other crop plants.

tobacco; endophytic bacteria; population; characteristic analysis

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.017

TS414 文獻標志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）03-0102-06

由云南省煙草公司科技項目（No.2012YN06）;云南省應用基礎研究青年項目（No.2013FD040）;國家自然科學基金項目（No.41361056）;昆明學院大學生科研項目（No.DXS14070）

陳澤斌（1985—）,博士,講師,研究方向：植物內(nèi)生細菌多樣性,Email：zbchenkmu@163.com

夏振遠（1971—）,碩士,研究員,研究方向：煙草微生物的利用和控制,Tel：0871-65106032,Email：zyxia@yntsti.com

2013-06-07