張霞等

摘要：從海島棉Pima S-6中鑒定了一個(gè)1號(hào)染色體上穩(wěn)定表達(dá)的纖維長(zhǎng)度QTL（qFL-chr1），針對(duì)這一目標(biāo)QTL，通過(guò)標(biāo)記輔助選擇得到近等基因系R01-40-08。近等性分析結(jié)果表明，該近等基因系其他7條染色體上仍含有 Pima S-6 的漸滲片段。以Tamcot 2111（輪回親本）與R01-40-08（供體親本）構(gòu)建了1個(gè)含有1 672個(gè)單株的F2群體，分析了其他染色體上Pima S-6漸滲片段對(duì)纖維長(zhǎng)度的遺傳效應(yīng)，單標(biāo)記分析結(jié)果表明，位于14號(hào)染色體上的2個(gè)標(biāo)記（NAU2190 和NAU5465）對(duì)纖維長(zhǎng)度有顯著的影響。

關(guān)鍵詞：纖維長(zhǎng)度；漸滲系；近等基因系

中圖分類號(hào)： S562.032文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0085-03

收稿日期：2014-04-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31171595）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（12）5039]。

作者簡(jiǎn)介：張霞（1988—），女，山東莒縣人，碩士研究生，主要從事棉花分子育種研究。Tel：（025）84390291；E-mail：zxia_1988@163.com。

通信作者：沈新蓮，博士，研究員，主要從事棉花分子育種研究。Tel：（025）84390291；E-mail：xlshen68@126.com。棉花是世界上重要的纖維作物，纖維品質(zhì)是評(píng)價(jià)棉花品種的重要指標(biāo)之一。纖維長(zhǎng)度、纖維強(qiáng)度等重要品質(zhì)指標(biāo)與棉花產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系[1-5]，這些因素制約了棉纖維品質(zhì)的遺傳改良。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為研究纖維品質(zhì)的遺傳和改良提供了一條新途徑，迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用不同的優(yōu)質(zhì)纖維材料篩選并鑒定了100多個(gè)與纖維長(zhǎng)度相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)[6]。目前，這些研究所用的群體都為F2、BC1和重組自交系群體，群體遺傳背景較復(fù)雜，存在如QTL間的互作與QTL與環(huán)境的互作，導(dǎo)致所估計(jì)的QTL的效應(yīng)與位置的精確性有限。由這些群體獲得的QTL的分辨率通常在10～30 cM之間[7-8]。在這樣大的區(qū)間內(nèi)，可能存在多個(gè)連鎖的QTL，無(wú)法分解緊密連鎖的負(fù)相關(guān)性狀QTL，影響標(biāo)記輔助選擇的效率以及對(duì)分子機(jī)理的研究。

近年來(lái)，近等基因系被廣泛用于植物數(shù)量性狀QTL的精細(xì)定位研究中[9-11]，因?yàn)榻然蛳抵缓泄w的1個(gè)至幾個(gè)漸滲片段，性狀的復(fù)雜性被降低到類似于由單基因控制的性狀，可以更精確地估計(jì)QTL的效應(yīng)、研究QTL之間的互作及QTL與環(huán)境的互作，在目標(biāo)QTL區(qū)域形成的重疊漸滲系可以促進(jìn)數(shù)量性狀基因的精細(xì)作圖，降低連鎖累贅程度，最終完成QTL圖位克隆。除了目標(biāo)染色體區(qū)域外，近等基因系通常含有一定數(shù)量的供體染色體片段，這些遺傳背景對(duì)目標(biāo)QTL的效應(yīng)具有影響，影響目標(biāo)QTL的精細(xì)定位及遺傳效應(yīng)估計(jì)。

在前期研究中，美國(guó)佐治亞大學(xué)通過(guò)回交高代QTL作圖方法，從海島棉Pima S-6中篩選、鑒定了1個(gè)1號(hào)染色體上的纖維長(zhǎng)度QTL（qFL-chr1），該QTL解釋的表型變異較高（12%～24%），而且在多個(gè)群體中均能檢測(cè)到[12]。針對(duì)這一目標(biāo)QTL，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院與美國(guó)佐治亞大學(xué)通過(guò)標(biāo)記輔助選擇共同培育了近等基因系R01-40-08，該近等基因系在美國(guó)、中國(guó)南京的多年多點(diǎn)試驗(yàn)中纖維長(zhǎng)度均顯著高于輪回親本Tamcot 2111[13]。本研究以Tamcot 2111與R01-40-08為親本構(gòu)建了1個(gè)F2群體，分析了其他染色體上Pima S-6漸滲位點(diǎn)對(duì)纖維長(zhǎng)度的遺傳效應(yīng)，以期構(gòu)建高遺傳相似度的纖維長(zhǎng)度單QTL近等基因系，為后期纖維長(zhǎng)度QTL圖位克隆提供重要的材料基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院與美國(guó)佐治亞大學(xué)通過(guò)標(biāo)記輔助選擇共同培育了1個(gè)增效基因來(lái)源于海島棉Pima S-6的纖維長(zhǎng)度QTL單片段漸滲系R01-40-08。

1.2群體構(gòu)建

2008年，將R01-40-08種植在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物試驗(yàn)基地，以Tamcot 2111為母本與R01-40-08供體親本雜交獲F1；同年冬季將F1種植在海南試驗(yàn)基地，自交得F2；2009年將F2群體（共1 672個(gè)單株）種植在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物科學(xué)試驗(yàn)基地，收獲重組個(gè)體單株籽棉，棉樣送交農(nóng)業(yè)部纖維檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)纖維品質(zhì)。2010年重組個(gè)體家系種植在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溧水植物科學(xué)試驗(yàn)基地，重復(fù)2次，按家系收獲籽棉，棉樣送交農(nóng)業(yè)部纖維檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)纖維長(zhǎng)度（FL）。纖維長(zhǎng)度由HVI900纖維品質(zhì)測(cè)試儀檢測(cè)。

1.3SSR分析

DNA采用改進(jìn)的CTAB法提取[14]。引物參照Guo等發(fā)表的遺傳圖譜選擇[15-16]。SSR參照文獻(xiàn)[17]分析。

1.4單標(biāo)記分析

根據(jù)分子標(biāo)記結(jié)果將數(shù)據(jù)分組，利用方差相同的t測(cè)驗(yàn)檢驗(yàn)組間平均數(shù)的差異，確定標(biāo)記與性狀的連鎖關(guān)系[18]。把性狀與標(biāo)記的回歸方程中的決定系數(shù)作為標(biāo)記能夠解釋性狀的效應(yīng)[19]。

2結(jié)果與分析

2.1近等基因系R01-40-08的近等性分析

為了分析近等基因系R01-40-08與輪回親本的遺傳相似度，根據(jù)已發(fā)表的2個(gè)棉花遺傳連鎖圖譜[15-16]，選擇534個(gè)分布于棉花整個(gè)基因組的SSR引物分析漸滲系R01-40-08與供體親本Pima S-6和輪回親本Tamcot 2111之間的多態(tài)性。結(jié)果表明，供體親本Pima S-6和輪回親本Tamcot 2111呈現(xiàn)多態(tài)性的引物有413個(gè)，其中R01-40-08和輪回親本Tamcot 2111之間呈現(xiàn)多態(tài)性的引物23個(gè)。其中1號(hào)染色體11個(gè)（BNL2921、JESPR240、NAU422、MUSS84、MUSS422、CIR018、JESPR56、NAU2182、TMD03以及BNL3090和STS引物（STS38）1對(duì)、2號(hào)染色體1個(gè)（NAU2858）、3號(hào)染色體2個(gè)（NAU1167和NAU5445）、14號(hào)染色體3個(gè)（NAU2190、NAU3820、NAU5465）、15號(hào)染色體1個(gè)（NAU2573）、19號(hào)染色體3個(gè)（NAU3110、NAU1221、NAU1042）、20號(hào)染色體1個(gè)（NAU3407）、23號(hào)染色體1個(gè)（NAU3732）。遺傳背景相似性估計(jì)=N/S×100%，式中：N表示R01-40-08和輪回親本Tamcot 2111之間為單態(tài)的標(biāo)記數(shù)，S表示供體親本Pima S-6和輪回親本Tamcot 2111之間呈現(xiàn)多態(tài)性的引物總數(shù)（390/413=94.43%），因此漸滲系含有輪回親本Tamcot 2111的94.43%基因組。

前期研究中在回交高代QTL分析中發(fā)現(xiàn)，除了1號(hào)染色體外，14、15、20、23號(hào)染色體上也存在纖維長(zhǎng)度QTL[12]?；赗FLP和SSR的遺傳圖譜[20]和SSR標(biāo)記的遺傳圖譜[15]中的橋梁標(biāo)記，由此推斷14、15、23號(hào)染色體上的Pima S-6遺傳位點(diǎn)與纖維長(zhǎng)度QTL連鎖較緊密，可能這些位點(diǎn)對(duì)纖維長(zhǎng)度QTL依然存在遺傳效應(yīng)。

2.2Pima S-6背景遺傳位點(diǎn)對(duì)纖維長(zhǎng)度的影響

為了進(jìn)一步證實(shí)Pima S-6遺傳背景對(duì)纖維長(zhǎng)度的影響，本研究以Tamcot 2111為母本與R01-40-08供體親本構(gòu)建了1個(gè)含有1 672個(gè)單株的F2群體。根據(jù)目標(biāo)QTL區(qū)間分子標(biāo)記基因型的篩選，共鑒定了432個(gè)重組個(gè)體，用上述12對(duì)位于非目標(biāo)QTL區(qū)間上的引物對(duì)F2群體的重組個(gè)體進(jìn)行基因型鑒定并進(jìn)行單標(biāo)記分析，根據(jù)基因型鑒定結(jié)果，對(duì)單標(biāo)記帶型含有Pima S-6片段與不含有Pima S-6片段進(jìn)行方差分析。對(duì)2009年F2群體背景標(biāo)記對(duì)纖維長(zhǎng)度單標(biāo)記分析結(jié)果，遺傳背景中Pima S-6位點(diǎn)對(duì)纖維長(zhǎng)度影響不顯著；對(duì)2010年F3群體單標(biāo)記分析結(jié)果，14號(hào)染色體上的2個(gè)標(biāo)記NAU2190 和NAU5465對(duì)纖維長(zhǎng)度有顯著的影響（表1）。15、23號(hào)上的Pima S-6遺傳位點(diǎn)對(duì)纖維長(zhǎng)度沒(méi)有影響，可能在回交的過(guò)程中Pima S-6遺傳位點(diǎn)與纖維長(zhǎng)度QTL已發(fā)生重組，不存在連鎖關(guān)系。

表1Pima S-6遺傳背景單標(biāo)記方差分析

標(biāo)記染色體貢獻(xiàn)率（%）P值2009年2010年2009年2010年NAU1167Chr.33.65.40.870.20NAU3820Chr.142.21.90.630.48NAU5465Chr.1400.30.240.022NAU2190Chr.140. 21.80.110.005NAU1221Chr.196.83.50.890.22NAU3110Chr.191.43.70.160.31NAU3407Chr.201.900.640.16NAU3732Chr.231.70.10.630.81

3結(jié)論與討論

隨著QTL定位技術(shù)在各種作物中的廣泛應(yīng)用，借助分子連鎖圖譜進(jìn)行QTL分析以及對(duì)目標(biāo)QTL構(gòu)建近等基因系，通過(guò)構(gòu)建NIL群體來(lái)進(jìn)行QTL的精確定位，可以使復(fù)雜的數(shù)量性狀也能像孟德?tīng)栆蜃右粯舆M(jìn)行分析，進(jìn)而通過(guò)圖位克隆來(lái)獲得數(shù)量性狀位點(diǎn)基因，最大限度挖掘有利基因位。近等基因系可通過(guò)連續(xù)多次回交法[21]、從突變體中分離獲得[22]和雜交高世代群體中分離選育[23]等方法。利用分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合連續(xù)回交選育法是獲得近等基因系最有效的手段。在回交過(guò)程中，除了目標(biāo)性狀基因轉(zhuǎn)移外，盡快恢復(fù)輪回親本的基因組是構(gòu)建近等基因系的關(guān)鍵。除了目標(biāo)染色體區(qū)域外，近等基因系通常含有一定數(shù)量的供體染色體片段，這些遺傳背景對(duì)目標(biāo)QTL效應(yīng)產(chǎn)生影響，從而影響目標(biāo)QTL的精細(xì)定位及遺傳效應(yīng)的估計(jì)。

本研究中的近等基因系R01-40-08是通過(guò)回交高代QTL作圖方法并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇創(chuàng)造獲得的。Yamamoto等曾使用經(jīng)典的高世代回交方法獲得近等基因系并精細(xì)定位和克隆了水稻抽穗期QTL[24-25]。盡管該方法獲得近等基因系耗時(shí)較長(zhǎng)，但由于近等基因系與輪回親本背景高度相似，所以極適合微效QTL遺傳效應(yīng)的估計(jì)。近等性分析表明，R01-40-08 已含有輪回親本94.43%的基因組，背景中仍含有少量Pima S-6漸滲位點(diǎn)。在對(duì)棉花1號(hào)染色體上纖維長(zhǎng)度QTL精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，繼續(xù)選擇在目標(biāo)QTL區(qū)間含有較小漸滲片段的重組個(gè)體，與輪回親本回交，并結(jié)合前景與背景分子標(biāo)記輔助選擇以及表型鑒定，可以獲得遺傳背景與輪回親本高度相似的單QTL近等基因系。這些纖維長(zhǎng)度單QTL近等基因系的獲得為數(shù)量性狀位點(diǎn)圖位克隆和基于單個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)下纖維發(fā)育的分子機(jī)制研究創(chuàng)造重要的材料。

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