許一鳴，仲崇俊，田 婷，肖 平

（南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科,江蘇226001）

食管癌是食管上皮組織常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)病率在惡性腫瘤中居第8位，病死率居第6位。全世界每年有48萬(wàn)新增病例[1]，而我國(guó)是世界上食管癌發(fā)病率和病死率最高的國(guó)家。食管癌的預(yù)后較差，總的5年生存率只有8%～30%。食管鱗狀細(xì)胞癌是中國(guó)食管癌主要病理類(lèi)型[2]。近年來(lái)隨著微小RNA的發(fā)現(xiàn)，微小RNA與人類(lèi)食管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系成為新的熱點(diǎn)。我院2012年7月—2013年12月住院手術(shù)治療并經(jīng)病理明確診斷食管癌患者60例，我們?cè)谇捌谘芯恐凶C實(shí)，let-7e在食管癌組織中表達(dá)水平高于癌旁組織，本課題將進(jìn)一步闡述let-7e與食管鱗癌臨床分期的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 食管癌患者60例，男36例，女24例，年齡 42～76 歲，平均 62.2±6.07 歲。鱗癌 32 例，腺癌28例；發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移者34例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移26例；根據(jù)第7版TNM系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期23例，Ⅲ期16例。所有患者均未接受放化療。本項(xiàng)研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法 （1）組織標(biāo)本收集與處理：患者腫瘤組織標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織（離癌組織＞1cm）樣本手術(shù)后30分鐘內(nèi)液氮冷凍后保存于-70℃冰箱待檢。（2）儀器和試劑：熒光PCR引物及探針使用Primer Express軟件(AB)設(shè)計(jì)，試劑采用是 AB（美國(guó)）公司的 TaqManMicroRNA Assays、TaqManMicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqManUniversal PCR Master Mix等試劑試劑盒，MicroRNAlet-7e TaqManMGB引物及探針由AB公司合成。（3）RNA提取：癌組織及癌旁組織總RNA分離采用mirVana miRNA Isolation Kit(AB)；（4）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：7.00μL總反應(yīng)體系輕輕混勻，稍微離心，用前置于冰上。每個(gè)樣品取5.0μL RNA與7.0μl RT-MIX混合，然后加入3.0μL 5×RT PRIMER，輕輕混勻。按照16℃30min,42℃ 30min,85℃,5min,4℃條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。（5）熒光定量PCR：以看家基因U6 snRNA做為內(nèi)參，反應(yīng)體系為 20μL(1.33μL RT product,1.0μL of 20×TaqMan miRNA Assay Mix,10.0μL of 2×Taq-Man PCR Master Mix,and 7.67μL nuclease-free water),使用基于分析系統(tǒng)軟件sds2.3的實(shí)時(shí)定量PCR儀ABI7900 HT，對(duì)癌組織及癌旁組織進(jìn)行內(nèi)參基因及目標(biāo)基因MicroRNAlet-7e按照95℃ 10 min預(yù)變性，95℃ 15s，60℃ 60s熒光檢測(cè)1次，共40個(gè)循環(huán)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到相應(yīng)Ct值。（6）癌組織及癌旁組織分別同時(shí)進(jìn)行內(nèi)基因基因U6 snRNA及MicroRNAlet-7e擴(kuò)增,分別q–PCR3次，得出Ct值均值，以癌旁組織為對(duì)照，應(yīng)用ΔΔCt法計(jì)算癌組織對(duì)比癌旁組織MicroRNAlet-7e表達(dá)相差倍數(shù)，得出為正值，即癌組織表達(dá)水平比癌旁組織表達(dá)水平高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量指標(biāo)采用±s表示，One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test計(jì)算結(jié)果分析數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，應(yīng)用t檢驗(yàn)分析MicroRNAlet-7e表達(dá)差異與不同臨床分期的關(guān)系，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MicroRNA let-7e在食管癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá) 以癌旁組織為對(duì)照，以看家基因U6 snRNA為內(nèi)參，應(yīng)用ΔΔCt計(jì)算出癌組織MicroRNA let-7e的表達(dá)水平比癌旁組織高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.3183，P＜0.05），可信區(qū)間 95%。見(jiàn)表 1、圖 1。2.2 MicroRNA let-7e含量與食管癌組織病理特征的相關(guān)性 MicroRNA let-7e表達(dá)水平與患者性別、組織學(xué)類(lèi)型、淋巴轉(zhuǎn)移、分化程度、分期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），I期與 III期相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 2。

表1 MicroRNA let-7e在食管癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)（±s）

表1 MicroRNA let-7e在食管癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)（±s）

組別例數(shù)Ct（let）Ct（U6）ΔΔCt癌旁組織 60 24.78±1.08 13.14±0.56 11.64±1.02癌組織 60 26.55±0.97 14.21±0.87 12.34±0.86

圖1 癌組織與癌旁組織MicroRNAlet7e表達(dá)倍數(shù)圖表

表2 MicroRNA let-7e含量與食管癌組織病理特征的相關(guān)性（例，±s）

表2 MicroRNA let-7e含量與食管癌組織病理特征的相關(guān)性（例，±s）

a：高分化組與中分化組相比；b：中分化組與低分化組相比較；c：高分化組與低分化組相比；d：I期與II期相比；e：II期與 III期相比；f：I期與 III期相比。*P＜0.05。

病理特征 分類(lèi) 例數(shù) ΔΔCt t P性別 男 36 11.306±6.261 0.799 0.381女 24 8.807±5.945組織學(xué)類(lèi)型 鱗癌 32 11.283±6.475 0.498 0.488腺癌 28 11.399±6.083淋巴轉(zhuǎn)移 有 34 9.121±5.531 2.224 0.032*無(wú) 26 13.545±6.816分化程度 高分化 9 14.833±6.500 0.201a 0.842中分化 19 14.283±6.857 2.192b 0.037*低分化 32 9.165±5.366 2.189c 0.041*病理分期 Ⅰ 21 13.011±5.430 0.750d 0.461Ⅱ 23 14.912±6.752 3.015e 0.006*Ⅲ 16 8.010±5.585 2.312f 0.029*

3 討 論

人類(lèi)MicroRNAs let-7家族由13個(gè)成員組成[3]，MicroRNAlet-7家族是由Reinhart等首次在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)(Celegans)發(fā)育后期發(fā)現(xiàn),是線(xiàn)蟲(chóng)時(shí)序性發(fā)育的關(guān)鍵性調(diào)控因子。在Celegans中，長(zhǎng)約21nt，從具有莖環(huán)折疊結(jié)構(gòu)、70個(gè)核苷酸前體分子發(fā)展而來(lái)的，參與細(xì)胞形態(tài)發(fā)生及表達(dá)。Let-7e不同于家族中其他成員，作為一種具有抑癌作用的微小RNA，成為目前腫瘤研究熱點(diǎn)。

我們首次應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR Taqman MGB探針?lè)?，檢測(cè)MicroRNA let-7e在食管鱗癌60例癌組織及癌旁組織中表達(dá)水平的差異。研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA let-7e在食管癌癌組織表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且在不同臨床分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。進(jìn)一步證實(shí)其在食管癌癌組織中，MicroRNA let-7e的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織表達(dá)，認(rèn)為MicroRNA let-7e可以作為臨床食管鱗癌臨床分期的分子生物學(xué)標(biāo)記。

研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌組織與正常食管粘膜組織存在大量差異表達(dá)的基因，這些基因與細(xì)胞增殖分化凋亡的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。miRNA分子是一類(lèi)長(zhǎng)18～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。即通過(guò)阻遏局部互補(bǔ)的mRNA的堿基配對(duì)的翻譯，從而抑制基因的表達(dá)，它是公認(rèn)的抑制基因表達(dá)生物過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[4]。文獻(xiàn)報(bào)道在食管鱗癌中，表達(dá)異常的微小RNA包括miR-143、miR-145、miR-21、miR-27a、miR-375 等[5-6]，而 let-7e在食管癌中相關(guān)報(bào)道不多。本研究發(fā)現(xiàn)，microRNA let-7e在癌組織的表達(dá)水平比癌旁組織高，且臨床分期越高，其增高程度越明顯。不同臨床分期的microRNA let-7e表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明microRNA let-7e可作為判斷食管鱗癌預(yù)后的指標(biāo)。Shell等[7]發(fā)現(xiàn)，let-7e的靶基因HMGA2是一個(gè)較理想的預(yù)測(cè)預(yù)后的標(biāo)志物。其表達(dá)水平聯(lián)合let-7e對(duì)患者預(yù)后的評(píng)價(jià)效果優(yōu)于傳統(tǒng)標(biāo)志物，可作為癌癥的診斷指標(biāo)；Larsen[8]利用基因表達(dá)分析技術(shù)證實(shí)鱗癌生存期的長(zhǎng)短與基因表達(dá)結(jié)果平行。Chen等[9]報(bào)道m(xù)iRNA調(diào)節(jié)食管鱗癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miRNA表達(dá)顯著升高，miRNA高表達(dá)的患者預(yù)后較差。Ogawa R等[10]報(bào)道，miR-129的高表達(dá)造成的早期病死率為低表達(dá)者18.11倍，表明miRNA的高表達(dá)對(duì)食管鱗癌的預(yù)后起著重要作用。Hong等[11]研究結(jié)果顯示，miRNA低表達(dá)與食管癌患者較長(zhǎng)的生存期相關(guān)。

MiRNA let-7e在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中有非常重要的作用。但在食管癌診斷和治療中的研究還有所欠缺，而且其標(biāo)本來(lái)源主要是患者的癌變組織，由于這一來(lái)源有限且提取步驟繁瑣，間接影響到結(jié)果的準(zhǔn)確性[12]。而在腫瘤患者的血液或尿液中存在著相對(duì)特異的miRNA表達(dá)譜，且穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好?？蓪⑵渥鳛槟[瘤早期診斷、個(gè)性化治療、預(yù)后監(jiān)測(cè)或跟蹤隨訪(fǎng)的非創(chuàng)傷性生物標(biāo)志物[13]。此外，在食管癌的高發(fā)地區(qū)，如中國(guó)、日本和亞洲其他國(guó)家的食管癌高發(fā)地區(qū)，以鱗型細(xì)胞癌多見(jiàn)，而在歐美國(guó)家食管癌低發(fā)地區(qū)則以腺癌為主。不同組織類(lèi)型的食管癌與miRNA let-7e的影響有多大尚不清楚，還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，在食管鱗癌中，miRNA let-7e通過(guò)調(diào)節(jié)不同的下游靶基因的表達(dá)參與了腫瘤的發(fā)生。miRNA let-7e的發(fā)現(xiàn)和深入研究對(duì)于食管鱗癌有著重要的臨床意義：具有高危險(xiǎn)基因表達(dá)的食管鱗癌患者，可以從輔助化療中獲益，而低危險(xiǎn)基因表達(dá)的患者可以省去不必要的治療。

[1]Ferlay J,Shin HR,Bray F,et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer,2010,127(12):2893-2917.

[2]Mathé EA,Nguyen GH,Bowman ED,et al.MicroRNA expression in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the esophagus:associations with survival[J].Clin Cancer Res,2009,15(19):6192-6200.

[3]Torrisani J,Bournet B,Du Rieu MC,et al.let-7 MicroRNA transfer in pancreatic cancer-derived cells inhibits in vitro cell proliferation but fails to alter tumor progression[J].Hum Gene Ther,2009,20(8):831-844.

[4]董令儀,張輝,葉穎江.miR-221和miR-222在腫瘤中的研究進(jìn)展[J].國(guó)際腫瘤學(xué)雜志,2012,39(5):330-333.

[5]David S,Meltzer SJ.MicroRNA involvement in esophageal carcinogenesis[J].Curr Opin Pharmacol,2011,11(6):612-616.

[6]Wu BL,Xu LY,Du ZP,et al.MiRNA profile in esophageal squamous cell carcinoma:downregulation of miR-143 and miR-145[J].World J Gastroenterol,2011,17(1):79-88.

[7]Shell S,Park SM,Radjabi AR,et al.Let-7 expression defines two differentiation stages of cancer[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(27):11400-11405.

[8]Larsen JE,Pavey SJ,Bowman R,et al.Gene expression of lung squamous cell carcinoma reflects mode of lymph node involvement[J].Eur Respir J,2007,30(1):21-25.

[9]Chen ZL,Zhao XH,Wang JW,et al.microRNA-92a promoteslymph nodemetastasisofhuman esophageal squamous cell carcinoma via E-cadherin[J].J Biol Chem,2011,286(12):10725-10734.

[10]Ogawa R,Ishiguro H,Kuwabara Y,et al.Expression profiling of micro-RNAs in human esophageal squamous cell carcinoma using RT-PCR[J].Med Mol Morphol,2009,42(2):102-109.

[11]Hong L,Han Y,Zhang H,et al.The prognostic and chemotherapeutic value ofmiR-296 in esophageal squamous cell carcinoma[J].Ann Surg,2010,251(6):1056-1063.

[12]余江流,凌志強(qiáng),毛偉敏.食管癌相關(guān)微小RNA研究進(jìn)展[J].國(guó)際腫瘤學(xué)雜志,2011,38(12):920-922.

[13]邱振華,高艷,王茂生,等.微小RNA與腫瘤[J].國(guó)際腫瘤學(xué)雜志,2012,39(5):333-337.