苗祥宇，徐麗，劉紅，張碩偉，吳情（江蘇省宿遷市人民醫(yī)院感染科 223800）

全球范圍內(nèi)原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）發(fā)病率位居惡性腫瘤第5位，約55%的病例發(fā)生在國(guó)內(nèi)［1］。多項(xiàng)研究已證實(shí)慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是導(dǎo)致HCC 的重要原因之一，約有10%～25%HBV 感染患者最終發(fā)展為HCC［2］。在國(guó)內(nèi)，90%以上HCC患者伴有HBV 感染［3］。近年來，越來越多的證據(jù)顯示，單核苷酸多態(tài)性（SNP）與腫瘤的遺傳易感性相關(guān)［4］。主要組織相容性復(fù)合體（MHC）－Ⅰ類鏈相關(guān)基因A（MICA）編碼一種應(yīng)激誘導(dǎo)性配體，主要與自然殺傷細(xì)胞（NK 細(xì)胞）活化型受體NKG2D 特異性結(jié)合，在NK 細(xì)胞活化和免疫監(jiān)視中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，MICA 多態(tài)性與惡性腫瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病等的易感性有密切關(guān)系。本研究旨在探討MICA 基因多態(tài)性以及血清中可溶性MICA 抗原含量與乙型肝炎源性HCC的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料將2009年9月至2013年6月本院收治并經(jīng)病理確診的HCC患者161例納入患者組，所有患者均為首次發(fā)病入院，未經(jīng)過放射、化學(xué)治療的患者；其中男131例，女30例，患者年齡22～80歲，平均（47.2±12.5）歲；所有患者乙型肝炎表面抗原（HBsAg）均為陽性。將同期無血緣關(guān)系、在本院體檢健康者162例納入健康對(duì)照組，其中男130例，女32例；年齡24～74歲，平均（45.6±11.8）歲。兩組受試者性別、年齡等一般資料比較，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取基因組DNA 提取采用Wizard基因組DNA 純化試劑盒（美國(guó)Promega公司），操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。分光光度計(jì)分析DNA 濃度和純度，將濃度調(diào)整為50ng／μL。

1.2.2 基因分型運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)MICA 基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2596542進(jìn)行基因分型。引物序列為：上游5′－TCG TCT CCC AAA GAA CAG CTA C－3′，下游5′－CCA GTC TCT GGA GTC ACT GTC－3′。PCR 總反應(yīng)體系為25μL，含DNA 模板1μL，2×PCR mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA 聚合酶0.5μL，去離子水9μL。PCR 預(yù)變性94℃5min，變性94℃30s、退火60℃30s、延伸72℃30s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段為492bp。

1.2.3 血清MICA 水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、人MICA 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Sigma－Ald rich公司），操作按照說明書進(jìn)行操作。所有樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，設(shè)置酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm，讀取吸光度值，根據(jù)MICA 標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。Logistic回歸分析法計(jì)算比值比（OR）及95%置信區(qū)間（95%CI），以α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 既往史與家族史比較患者組中有吸煙史、飲酒史、HCC家族史者明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 患者組和健康對(duì)照組的既往史與家族史比較（n）

2.2 MICA 基因多態(tài)性與HCC風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)，健康對(duì)照組和患者組MICA 基因位點(diǎn)rs2596542基因型實(shí)際值與預(yù)測(cè)值比較，均符合Hardy－Weinberg 平衡（χ2＝2.344，P＝0.125和χ2＝3.420，P＝0.064）?；颊呓M中GG 基因型的分布頻率為23.6%，明顯高于健康對(duì)照組的16.0%，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GG 基因型攜帶者HCC 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是AA 基因型攜帶者的1.860倍（OR＝1.860，95%CI：1.009～3.428）。攜帶G 等位基因者HCC 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于A 等位基因攜帶者（OR＝1.412，95%CI：1.030～1.936）。

表2 rs2596542基因型在患者組與健康對(duì)照組的分布［n（%）或n］

2.3 MICA 基因多態(tài)性與血清MICA 水平本研究采用ELISA 方法對(duì)HCC患者和健康體檢者血清MICA 水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)患者組MICA 水平為（55.1±21.3）pg／mL，明顯高于健康對(duì)照組的（9.7±4.3）pg／mL，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步分析MICA 基因多態(tài)性與血清MICA 水平的關(guān)系，結(jié)果顯示，GG 基因型患者血清MICA 水平為（89.1±41.7）pg／mL，明顯高于AA 基因型的（18.2±9.5）pg／mL和AG 基因型的（35.8±17.4）pg／mL，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

MICA 基因是MIC基因家族的成員之一。MICA 是功能基因，在人體正常組織細(xì)胞表達(dá)量極低［5］。研究發(fā)現(xiàn)，MICA基因在大多數(shù)上皮來源的原發(fā)性腫瘤，如肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等細(xì)胞上表達(dá)，被認(rèn)為與惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)［6］。NK 細(xì)胞活化受體NKG2D 可以識(shí)別表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面的MICA／B。這些識(shí)別無須抗原處理和遞呈，并且無MHC 限制性。MICA／B與NKG2D 結(jié)合刺激NK 細(xì)胞的活化。膜MICA 可上調(diào)效應(yīng)細(xì)胞NKG2D 的表達(dá)，而膜MICA 可被基質(zhì)金屬蛋白酶水解釋放入血液?？扇苄訫ICA 的釋放不僅降低腫瘤細(xì)胞表面MICA 的表達(dá)，降低腫瘤的免疫原性，也能影響免疫效應(yīng)細(xì)胞表面NKG2D 的表達(dá)，進(jìn)而影響NK 細(xì)胞和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL細(xì)胞）抗腫瘤效應(yīng)的發(fā)揮。張彩等［7］的研究也表明，可溶性MICA 通過降低NKG2D 的表達(dá)下調(diào)機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)。上述研究表明，NKG2D－MICA 的相互作用可有效調(diào)節(jié)NK 細(xì)胞和CTL細(xì)胞的殺腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎源性HCC 患者血清MICA 水平明顯高于健康對(duì)照組（P＜0.05），說明可溶性MICA 在肝癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用，這種作用與腫瘤免疫逃逸作用機(jī)制有關(guān)。

人類MHC基因域位于6號(hào)染色體短臂，共含有224個(gè)基因座，包含MIC家族7個(gè)成員的編碼基因，其中MICA 位于經(jīng)典MHC－Ⅰ類基因域著絲粒的末端，具有6個(gè)外顯子，由5個(gè)內(nèi)含子隔開［8］。Kumar等［9］發(fā)現(xiàn)MICA 上游4.7kb的變異位點(diǎn)與丙型肝炎病毒引起的HCC 相關(guān)。Paulisally等［10］研究了MICA 基因多態(tài)性與丙型肝炎源性肝癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SNP rs2596538與丙型肝炎源性肝癌易感性相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，另一個(gè)MICA SNP位點(diǎn)rs2596542與乙型肝炎源性HCC 易感性相關(guān)，G 等位基因攜帶者HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯大于A 等位基因攜帶者［11］。本研究結(jié)果與Kumar等［9］的研究類似，GG 基因型攜帶者比AA 基因型攜帶者乙型肝炎源性HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高；或至少攜帶1個(gè)G 等位基因者比攜帶A 等位基因者更易患乙型肝炎源性HCC。SNP rs2596538G 等位基因攜帶者血清MICA 水平高于A 等位基因攜帶者，rs2596542G 等位基因攜帶者高于A 等位基因的攜帶者。本研究也發(fā)現(xiàn)，GG 基因型HCC患者血清MICA 水平明顯高于AA 基因型和AG 基因型患者（P＜0.05）?；貧w分析結(jié)果顯示，GG 基因型攜帶者比AA 基因型攜帶者乙型肝炎源性HCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)要高。上述研究結(jié)果表明，MICA 基因多態(tài)性可能通過提高可溶性MICA 水平，從而影響HCC易感性。

綜上所述，隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和人類基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科向癌癥研究領(lǐng)域的延伸，HCC 分子診斷方法取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展［12］。MICA 基因多態(tài)性和血清MICA 有可能成為乙型肝炎源性HCC 的生物學(xué)標(biāo)記。其在臨床診斷中的作用有待進(jìn)一步研究。

［1］覃彥平，秦雪.白介素－23R基因多態(tài)性與肝癌易感性研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41（30）：3138－3141.

［2］Coffin CS，F(xiàn)ung SK，Ma MM.MaManagement of chronic hepatitis B：Canadian Association for the Study of the Liver consensus guidelines［J］.J Hepatol，2000，32（Suppl 1）：89－97.

［3］Thakur V，Guptan RC，Kazim SN，et al.Profile，spectrum and significance of HBV genotypes in chronic liver disease patients in the Indian subcontinent［J］.J Gastroenterol Hepatol，2002，17（2）：165－170.

［4］Akkiz H，Bayram S，Bekar A，et al.Relationship between functional polymorphism in the Aurora A gene and susceptibility of hepatocellular carcinoma［J］.J Viral Hepati，2010，17（9）：668－674.

［5］Bahram S，Bresnahan M，Geraghty DE，et al.A second lineage of mammalian major histocompatibility complex classⅠgenes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（14）：6259－6263.

［6］丁軍穎，王潤(rùn)田.人MICA 基因多態(tài)性和表達(dá)特性與腫瘤的關(guān)系［J］.現(xiàn)代免疫學(xué)，2007，27（2）：165－168.

［7］張彩，馮進(jìn)波，王郡甫，等.膜型分泌型MICA 對(duì)NK 細(xì)胞受體NKG2D 的相反調(diào)節(jié)效應(yīng)及其對(duì)NK 細(xì)胞受體譜的影響［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2004，24（2）：107－111.

［8］Shiina T，Tamiya G，Oka A，et al.Molecular dynamics of MHC genesis unraveled by sequence analysis of the 1，796，938－bp HLA classⅠregion［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（23）：13282－13287.

［9］Kumar V，Kato N，Urabe Y，et al.Genome－wideassociation study identifies a susceptibility locus for HCV－induced hepatocellular carcinoma［J］.Nat Genet，2011，43（5）：455－458.

［10］Paulisally Hau Yi Lo，Yuji Urabe，Vinod Kumar，et al.Identification of a functional variant in the MICA promoter which regulates MICA expression and increases HCV－related hepatocellular carcinoma risk［J］.PloS one，2013，8（4）：61279.

［11］Kumar V，Yi Lo PH，Sawai H，et al.Soluble MICA and a MICA variation as possible prognostic biomarkers for HBV－induced hepatocellular carcinoma［J］.PloS one，2012，7（9）：44743.

［12］董良倉(cāng)，柴麗.原發(fā)性肝癌的分子診斷［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2011，12（3）：134－135.