柳成益，楊 梅，唐 平＊＊，李小林，肖玉軍，鄭林用，王 云

(1.攀枝花市農(nóng)林科學研究院，四川 攀枝花 617061;2.四川省農(nóng)業(yè)科學院，四川 成都 610066;3.新西蘭皇家植物和食品研究所，新西蘭 基督城 8140)

塊菌隸屬子囊菌亞門 (Ascomycotina)、塊菌目 (Tuberales)、塊菌科 (Tuberaceae)、塊菌屬 (Tuber)，子囊果呈不規(guī)則的球形、半球形或塊狀[1]，是世界上最珍貴的可食用菌根菌之一，具有奇特的香味和營養(yǎng)價值，必須與適宜樹木營共生生活，因此產(chǎn)量有限，國際市場上價格昂貴，供不應(yīng)求，其中又以被譽為“黑鉆石”的黑孢塊菌 (Tuber melanosporum)和意大利白塊菌 (Tuber magnatum)最為昂貴[2]。

攀枝花塊菌 (T.panzhihuanense)子實體碩大[3]，單個重最大達到453 g，有清香味、肉質(zhì)細膩、口感較好，在云南松 (Pinus yunnanensis)林下產(chǎn)量大，是2010年到現(xiàn)在為止國內(nèi)發(fā)現(xiàn)具有較大商業(yè)潛力的唯一1個白色塊菌新種，極具商業(yè)價值。3 cm以上國內(nèi)市場價格在1 500元·kg－1～2 000元·kg－1，遠高于印度塊菌(500 元·kg－1～800元·kg－1)，攀枝花塊菌產(chǎn)量比較有限，市場供不應(yīng)求。為了能夠提高攀枝花塊菌產(chǎn)量，豐富國內(nèi)商業(yè)塊菌種類，有效保護現(xiàn)有資源，實現(xiàn)持續(xù)利用的目的，項目組成功培育出攀枝花塊菌菌根苗，采用形態(tài)學及分子生物學的方法確定了攀枝花塊菌與云南松能形成菌根，并觀察了菌根在生長過程中的形態(tài)變化，建立了云南松與攀枝花塊菌合成的菌根苗的顯微檢測方法，為實現(xiàn)攀枝花塊菌人工栽培奠定了堅實基礎(chǔ)，為世界塊菌人工栽培技術(shù)的突破增加1個新種。攀枝花塊菌菌根合成技術(shù)未見研究報道，本研究在塊菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展上對攀枝花塊菌的栽培以及攀枝花塊菌宿主植物的篩選有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種

攀枝花塊菌:子實體近球形或不規(guī)則、多凹凸、堅實、白色、絨毛濃密，直徑可達13 cm。有微香味。產(chǎn)孢組織黑灰或淺黑色，有淺白色的彎曲的脈紋。包被單層，由大型細胞和交織的菌絲組成 (圖1)。子囊孢子1枚～4枚，近球形至闊橢圓形，成熟時淺黑褐色，網(wǎng)狀紋飾。球形至擬球形、梭形、橢圓形或不規(guī)則形，無柄或具短柄 (3 μm×4 μm)，壁薄 (1 μm ～2 μm)[3](圖 2)。

1.1.2 供試樹種和材料

從昆明種子公司購買的云南松 (Pinus yunnanensis)種子，珍珠巖、蛭石、草炭土、鈣質(zhì)土、塑料筐、育苗缽等。

1.2 試驗方法

1.2.1 塊菌的處理和菌種的制備

塊菌成熟季節(jié)，在攀枝花市場上購買個頭大、外型好、香味濃的塊菌作為菌種，經(jīng)過表面滅菌處理粉碎后與滅菌土按比例混合配置成塊菌菌劑[4]。

1.2.2 育苗基質(zhì)的處理

接種前培育幼苗所用的基質(zhì)按照珍珠巖∶蛭石=1∶1的比例均勻混合裝入布袋中，在121℃～126℃下滅菌2 h。移植和接種苗培育基質(zhì)按照草炭土∶蛭石∶鈣質(zhì)土=1∶1∶1的比列混合均勻，pH值為6.0～7.0，裝入布袋中，在121℃～126℃下高壓滅菌2 h。

1.2.3 接種前幼苗培育

云南松種子用清水沖洗干凈，再用0.3%的高錳酸鉀溶液浸種消毒3 h，清水沖洗干凈，放置在相對潔凈的房間中，自來水浸種4 d，每天換1次清水。浸種后分別播種在已經(jīng)滅菌的混合基質(zhì)的塑料筐中，將塑料筐放置在恒溫室中進行培育，發(fā)芽1周葉面噴施1次營養(yǎng)液。

1.2.4 塊菌接種與管護

接種時選擇無菌培育3個月根系發(fā)達，苗色較好的幼苗，用消毒過的剪刀剪去主根。將配置好的菌劑接種在幼苗根上，使幼苗根系與菌劑緊密結(jié)合，接種量為2×106個孢子/株，接種后放置于自然溫室大棚中培養(yǎng)，用微噴保持基質(zhì)濕潤。

1.2.5 試驗設(shè)計與調(diào)查

試驗設(shè)計采用隨機區(qū)組設(shè)計:每個小區(qū)10株，重復3次。接種后用每間隔1個月隨機取5株，解剖鏡LEICA S6D和顯微鏡OLYMPYS BX－5觀察接種苗木的外延菌絲，記錄其特征并照相，隨機選取30個菌根測量菌根的長度和粗度。

1.2.6 菌根分子檢測

采攀枝花塊菌接種的云南松菌根20個左右，在體視菌下用毛刷刷掉泥土，清洗干凈，用改進的CTAB法提取菌根的DNA，通過ITS序列的辦法測定菌根上的真菌序列，ITS序列PCR擴增引物 ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC，ITS5:GGAAG TAA AAGTCGTAACAAGG)，擴增片段測序后與接種用的攀枝花塊菌ITS序列比較[5]，以確定形成菌根菌的是否是攀枝花塊菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根特征與菌根感染率檢測

攀枝花塊菌接種云南松樹苗3個月可形成菌根。菌根檢測時，先將云南松菌根苗根系用清水洗凈表面的泥土，菌根結(jié)構(gòu)肉眼便可觀察到，云南松菌根菌根呈單軸狀和二叉狀分枝 (圖3、圖4)。菌根形成初期顏色為感染初期菌根尖淡乳色，基部淡黃色、黃褐色，菌根表面外延菌絲直立的著生在菌根表面，且不分支，較堅硬，半透明 (圖3)，菌絲是從根系表皮細胞間隙向皮層伸展，并在皮層細胞之間交織成網(wǎng)狀。可清晰看到菌絲在營養(yǎng)根表繁殖，層層交織形成的菌套(Mantle)呈暗褐色 (圖5)，菌根橫切面上能觀察到哈蒂氏網(wǎng) (Hartig net)結(jié)構(gòu) (圖6)，菌根長到后期10個月左右，部分菌根就開始老化，變成褐色至黑色 (圖7)。未接種苗(CK)未見任何菌根形成，僅見粗短的根毛，營養(yǎng)根不膨大，先端尖銳 (圖8)。

攀枝花塊菌接種云南松樹無菌苗后，3個月左右開始感染形成菌根，隨著培育時間的延長，菌根的數(shù)量也隨之增加[4]，4個～6個月時，菌根的感染率達到90%～100%，經(jīng)過測量，接種形成菌根后的平均根長4.66 mm，平均菌根粗1.40 mm(圖4);未接種攀枝花塊菌的云南松菌根平均長3.38 mm，平均粗0.98 mm(圖8)，接種攀枝花塊菌形成菌根后能明顯促進根系的生長，地上部分的促生效果也比較明顯 (圖9)。

2.2 分子檢測

PCR擴增顯示，菌根提出的DNA能得到較單一的700 bp左右的條帶，測序結(jié)果表明，與云南松形成菌根的真菌為攀枝花塊菌。ITS序列同源性為100%，同時采用的是PCR產(chǎn)物直接測序，測序峰圖清晰，無重疊峰，說明與云南松形成菌根的只有攀枝花塊菌，沒有其它菌根類真菌。

3 討論

從接種菌根檢測的結(jié)果可以看出，攀枝花塊菌接種云南松宿主植物能形成很好的感染率，感染率在90%以上，所以可以得出云南松是比較好的宿主植物，用攀枝花塊菌接種云南松形成菌根的技術(shù)是成功的。

本研究采用形態(tài)學和分子檢測兩種方法確定了攀枝花塊菌與云南松能形成菌根，在中國白色塊菌栽培上具有重要的應(yīng)用意義。

攀枝花塊菌是2010年首次在國內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，目前還沒有人對它的自然分布、生長環(huán)境、宿主植物進行過系統(tǒng)調(diào)查，開展系統(tǒng)調(diào)查有助于攀枝花塊菌的人工栽培。

[1]Jasmina Glamoelija，Radmila Vujieic，Jele－na Vukojevie.Evidence of trufles in Serbia [J].Mycotaxon，1997(65):211－222.

[2]陳應(yīng)龍，弓明欽.塊菌資源多樣性及其地理分布[J].中國食用菌，2000，19(5):6－7.

[3]Xiao Juan Deng，Pei Gui Liu，Cheng Yi Liu.A new white truffle species，Tuber panzhihuanense from China [J].Mycol Progress，2013.12(3):557－561.

[4]蘇開美，李樹紅，楊麗芬，等.印度塊菌夏塊菌與化香樹合成菌根苗技術(shù)初探[J].中國食用菌，2012，31(3):10－12.

[5]柳成益，唐平，蘭海，等.印度塊菌菌根對苗木生長的影響[J].西南林學院學報，2008，28(6):21－24.