孫化鵬，張 珉，鐘曉紅*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 湖南 長(zhǎng)沙 410128； 2.湖南省林業(yè)科學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410004)

柿葉總黃酮超聲輔助提取工藝研究

孫化鵬1，張 珉2，鐘曉紅1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 湖南 長(zhǎng)沙 410128； 2.湖南省林業(yè)科學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410004)

通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選柿葉中總黃酮的超聲輔助提取工藝，并對(duì)湖南省不同地區(qū)、不同品種柿葉原料中總黃酮的含量進(jìn)行了分析比較。結(jié)果表明：超聲輔助提取柿葉總黃酮的最佳工藝條件為乙醇濃度60%、料液比1∶50、超聲時(shí)間30min、超聲溫度60℃；湖南省不同地區(qū)、不同品種的柿葉原料中總黃酮的含量有明顯差異，表明品種差異、地區(qū)差異以及栽培管理?xiàng)l件都是影響柿葉原料中總黃酮含量的重要因素。

柿葉；總黃酮；超聲輔助提??；品種

柿(DiospyroskakiThunb.)，又名朱果、猴棗，為柿樹(shù)科柿屬植物，落葉喬木，是湖南省一種重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[1]。柿全身都是寶，有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，柿葉、柿果、柿蒂、柿澀汁、柿霜、柿根均可入藥[2]。其中，柿葉為柿的新鮮和干燥葉片，味苦、性寒，是一味重要的中藥資源，具有很高的藥用功效，在臨床應(yīng)用中起到了越來(lái)越明顯的醫(yī)療作用[3-7]?，F(xiàn)代研究表明，柿葉藥材中黃酮化合物是其主要功能成分[8-10]。從柿葉中提取分離黃酮類化合物，對(duì)于柿葉藥材應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域，具有理論意義和實(shí)用價(jià)值。另一方面，柿屬植物種類繁多，不同品種柿樹(shù)的葉片中黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)和含量都有很大差別。湖南省作為我國(guó)柿樹(shù)原產(chǎn)地之一，地方品種較多，主要是澀柿品種多且為野生散植，但近年來(lái)成功引進(jìn)了多個(gè)優(yōu)良甜柿品種，柿果園栽培面積也在不斷發(fā)展擴(kuò)大。優(yōu)選黃酮類化合物含量高的柿葉原料，炮制成中藥材或者應(yīng)用于提取加工，對(duì)提高柿樹(shù)以及柿果園的綜合經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重要意義[11-12]。我們通過(guò)超聲輔助提取并設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)條件，對(duì)柿葉黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)，調(diào)查采集湖南省不同地區(qū)、不同品種的柿葉原料，分析比較黃酮類化合物的含量，以期優(yōu)選出高質(zhì)量的柿葉藥材。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品處理 采集湖南省不同地區(qū)不同品種的新鮮柿葉為材料，洗凈后置于60℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，粉碎后密封備用。正交試驗(yàn)用材料為湖南省長(zhǎng)沙市牛心柿柿葉粉末。

1.1.2 儀器和試劑 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；116搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(浙江永歷制藥機(jī)械有限公司)；電子分析天平(Shimadau公司)；循環(huán)水式多用真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)。

蘆丁對(duì)照品(天津尖峰天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)有限公司，純度≥98%)；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 柿葉總黃酮檢測(cè)方法 采用硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法測(cè)定柿葉中總黃酮含量，原理是鋁鹽在堿性條件下與黃酮類化合物形成絡(luò)合物，利用分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總黃酮含量[13-15]。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL濃度為0.1mg/mL的蘆丁對(duì)照液分別置于10mL容量瓶中，各加30%乙醇使成5mL，先加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，再加10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，再加4%氫氧化鈉溶液4mL，用蒸餾水稀釋到10mL，搖勻，放置15min，以第一管為空白，在最大吸收波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：

y=11.363x+0.0019，R2=0.9999。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度作為考察因素，按L9(34)設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)(見(jiàn)表1)，試驗(yàn)重復(fù)3次，以柿葉總黃酮的提取率為指標(biāo)篩選最佳提取工藝。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Thefactorsandlevelsoforthogonalexperiment水平因素A乙醇濃度(%)B料液比(g∶mL)C超聲時(shí)間(min)D超聲溫度(℃)1401∶3020402501∶4030503601∶504060

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS V19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 湖南省不同地區(qū)、不同品種柿葉總黃酮含量分析 精確稱取不同品種柿葉樣品粉末各1.0g，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳工藝條件超聲輔助提取，過(guò)濾后定容至100mL，即為待測(cè)樣品溶液，按照1.2.1檢測(cè)方法檢測(cè)分析，并計(jì)算柿葉總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 柿葉總黃酮超聲輔助提取工藝優(yōu)選

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，由表2極差分析可知，影響柿葉總黃酮提取率的主次因素由極差大小確定為：A>B>D>C，即乙醇濃度>料液比>超聲溫度>超聲時(shí)間。由表3方差分析可知，乙醇濃度、料液比和超聲溫度對(duì)柿葉總黃酮提取率的影響均達(dá)到了顯著水平。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，得出超聲輔助提取柿葉總黃酮的最佳工藝條件為：A3B3C2D3，即乙醇濃度為60%、料液比為1∶50、超聲時(shí)間為30min、超聲溫度為60℃時(shí)，能達(dá)到最佳的提取效果。由于A3B3C2D3組合并不在上述正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)之內(nèi)，需對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)5次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，其平均提取率為7.524%，RSD=1.60%，表明該最佳提取工藝重現(xiàn)性較好。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析表Tab.2 Resultsoforthogonalexperiment試驗(yàn)號(hào)ABCD吸光度提取率(%)111110.7276.36212220.7476.52313330.8247.18421230.8257.22522310.7926.91623120.8297.23731320.7956.95832130.8387.33933210.8587.50K120.0720.5320.9220.77K221.3620.7721.2420.70K321.7821.9121.0521.74R16.696.846.976.92R27.126.927.086.90R37.267.307.027.25極差R0.570.460.070.35 注:Kn=∑提取率n,n為因素的因子;Rn=Kn/3;極差R=maxRn-minRn。

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Resultsofvarianceanalysis方差來(lái)源平方和自由度均方F值顯著水平A0.50720.25443.355*B0.32720.16327.926*C▲D0.23920.11920.401*誤差0.01220.006 注:▲表示空閑因子,*表示顯著水平為0.05,**表示顯著水平為0.01。

2.2 湖南省不同地區(qū)、不同品種柿葉總黃酮含量比較

通過(guò)湖南省柿資源調(diào)查采樣，所采集的17份柿葉樣品中(見(jiàn)表4)，引進(jìn)栽培的甜柿品種主要包括次郎、陽(yáng)豐、新津20、三代斤等，且均以果園常規(guī)方式進(jìn)行管理；地方品種主要包括腰帶柿、盅柿、牛心柿、柿花、甜柿等，且均為散植。根據(jù)表4所示數(shù)據(jù)和圖1分析可知，17份柿葉樣品總黃酮含量差異明顯，其中祁陽(yáng)縣的次郎品種總黃酮含量最高，達(dá)到94.28mg/g；而含量最低的是洞口縣的腰帶柿，總黃酮含量?jī)H為10.92mg/g。綜合比較分析，引進(jìn)栽培的甜柿品種柿葉總黃酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于地方品種。進(jìn)一步分析可知，湖南省同一地區(qū)內(nèi)，不同柿樹(shù)品種之間柿葉總黃酮含量也有明顯差異，如從洪江市采集的樣品中，同為引進(jìn)栽培的甜柿品種，次郎的柿葉總黃酮含量要比陽(yáng)豐高22.89mg/g；并且同一品種在不同地區(qū)之間其柿葉總黃酮含量也有差異，如洪江市的腰帶柿樣品含量要比洞口縣的高出1倍左右。

表4 湖南省不同地區(qū)、不同品種柿葉總黃酮含量Tab.4 ThetotalflavonoidcontentofDiospyroskakileav-esfromdifferentvarietyanddifferentregionsinHunanProvince樣品編號(hào)品種名稱采集地總黃酮含量(mg/g)1次郎洪江市94.092陽(yáng)豐洪江市71.203新津20洪江市88.784貢柿洪江市89.255腰帶柿洪江市27.996三代斤祁陽(yáng)縣65.367次郎祁陽(yáng)縣94.288盅柿祁陽(yáng)縣39.359腰帶柿祁陽(yáng)縣18.2310腰帶柿洞口縣10.9211方柿洞口縣65.8412柿花溆浦縣52.2313柿花辰溪縣54.4014膏子柿辰溪縣53.8615無(wú)核柿桃源縣53.9616甜柿桃源縣55.9517牛心柿長(zhǎng)沙市70.76

圖1 17份樣品柿葉總黃酮含量比較Fig.1 Comparison of the total flavonoid content of Diospyros kaki leaves from 17 samples

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了超聲輔助提取柿葉總黃酮的最佳工藝條件：乙醇濃度為60%、料液比為1∶50、超聲時(shí)間為30min、超聲溫度為60℃。在此工藝條件下，柿葉總黃酮的提取率可達(dá)7.524%，且該工藝條件穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力，可以廣泛用于柿葉總黃酮含量的分析檢測(cè)，為篩選高質(zhì)量的柿葉藥材原料奠定了基礎(chǔ)。

通過(guò)對(duì)17份柿葉原料檢測(cè)得到的柿葉總黃酮含量分析可知，不同地區(qū)、不同品種的柿葉原料中總黃酮的含量有著明顯的差異，這就表明地區(qū)差異和品種差異均是影響柿葉黃酮類化合物含量的重要因素。并且通過(guò)進(jìn)一步分析來(lái)看，栽培管理?xiàng)l件好的甜柿品種柿葉原料中總黃酮的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于野生栽培環(huán)境中的澀柿品種，該結(jié)果表明柿栽培地的生態(tài)環(huán)境和栽培條件也是影響柿葉黃酮類化合物含量的重要因素。綜上所述，為進(jìn)一步提高柿園的綜合利用價(jià)值，獲得高質(zhì)量的柿葉藥材原料，要根據(jù)不同地區(qū)的生態(tài)環(huán)境和栽培條件優(yōu)選出適合該地區(qū)的最佳品種。

[1] 陳杰忠.果樹(shù)栽培學(xué)各論(南方本)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2003.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典:2010版一部[M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010.

[3] 王燕. 柿葉中黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2011, 7(4): 173-174.

[4] Sakanaka S, Tachibana Y, Okada Y. Preparation and antioxidant properties of extracts of Japanese persimmon leaf tea (kakinoha-cha) [J]. Food Chemistry, 2005, 89(4): 569-575.

[5] 張勝海, 王英姿, 段飛鵬, 等. 柿葉黃酮磷脂復(fù)合物的制備工藝研究[J]. 中草藥, 2013, 44(22): 3136-3140.

[6] 馬新博, 宮汝飛. 柿葉黃酮藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào), 2012, 40(4): 130-131.

[7] 梁宇紅, 陳麗, 吳鋼, 等. 柿葉黃酮緩釋片的制備及其釋放度測(cè)定[J]. 中成藥, 2013, 35(10): 2134-2137.

[8] 傅建敏, 梁晉軍, 周道順. 柿葉有效成分研究綜述[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 33(11): 66-71.

[9] 姜紅波, 趙衛(wèi)星, 馮國(guó)棟, 等. 柿葉的主要有效成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 化工時(shí)刊, 2010, 24(6): 38-43.

[10] 周江煜, 李耀華, 侯小濤, 等. 廣西產(chǎn)柿葉的HPLC指紋圖譜研究[J]. 華西醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 26(6): 583-584.

[11] 肖旭, 胡衛(wèi)健. 柿葉提取物和銀杏葉提取物治療椎-基底動(dòng)脈供血不足的臨床療效對(duì)比[J]. 四川醫(yī)學(xué), 2012, 33(5): 751-753.

[12] 衛(wèi)靜莉, 薛笑莉, 陳玉章. 提取柿葉黃酮類化合物的工藝研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2013, 34(13): 29-32.

[13] 孫化鵬，鐘曉紅，張珉，等. 超聲提取枸杞葉總黃酮的工藝研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2009，19(4)：2645-2648.

[14] 李良導(dǎo). 皺皮柑果皮中總黃酮的提取、純化及初步鑒定[D]. 長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[15] 王琴,張洪微,張愛(ài)武. 荷葉中黃酮類化合物提取的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工, 2011(4):78-80.

UltrasonicextractiontechnologyoftotalflavonoidfromDiospyroskakileaves

SUN Huapeng1, ZHANG Min2, ZHONG Xiaohong1*

(1.Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2.Hunan Academy of Forerstry, Changsha 410004, China)

Using orthogonal experimental design, the optimal extraction technology of total flavonoid fromDiospyroskakileaves by ultrasonic was selected, and the total flavonoid content in different varieties ofDiospyroskakiin Hunan Province was studied. The results showed that, the optimal extraction conditions were ethanol concentration 60%, ratio of material to solvent 1∶50, extraction by ultrasonic 30min and temperature 60℃. There was obviously distinction of the total flavonoid content among different varieties ofDiospyroskakileaves and different regions in Hunan Province, which indicated that species difference, regions difference and cultivation management are all the important factors to affect the content of total flavonoid inDiospyroskakileaves.

Diospyroskakileaves; total flavonoid; ultrasonic extraction; variety

2014-06-26

長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃項(xiàng)目(K1205012-21)。

*為通訊作者。

TQ 461

A

1003 — 5710(2014)05 — 0018 — 04

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2014. 05. 005

(文字編校：張 珉)