張躍進,常清利,汪倩,盧俊婉,2,王歡,李佩珍,應(yīng)俊,包其郁,胡云良

1.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,溫州 325000;2.麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)院,麗水 323000;3.溫州醫(yī)科大學(xué)護理學(xué)院,溫州 325000

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是僅次于大腸埃希菌(Escherichia coli)的重要臨床條件致病菌,主要引起醫(yī)院內(nèi)感染,能導(dǎo)致尿路感染、軟組織感染及敗血癥等多種疾病,并被認為是醫(yī)源性感染的一個指針[1]。世界范圍內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)由多重耐藥肺炎克雷伯菌所引起的醫(yī)院內(nèi)感染爆發(fā),還有研究認為克羅恩氏病(Crohn's disease)及強直性脊柱炎也與克雷伯菌感染有關(guān),肺炎克雷伯菌在新生兒病房是尤其危險的病源菌[2]。隨著多重耐藥菌株的增加,臨床用藥變得越來越復(fù)雜,肺炎克雷伯菌感染性疾病的致死率愈來愈高[3],極大地危害公共健康及安全。

整合子是一種可移動的DNA元件,含有位點特異重組系統(tǒng)和基因盒,能捕獲外源基因(尤其是耐藥性相關(guān)基因)并進行水平轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致耐藥性播散。整合子在臨床分離的革蘭陰性耐藥菌株中的檢出率可高于50%[4],是革蘭陰性菌耐藥基因捕獲和播散的主要機制。因此,對細菌耐藥性相關(guān)整合子的監(jiān)測,在分子水平研究細菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播顯得十分必要。本研究從臨床多重耐藥菌株著手,采用基因克隆等技術(shù),探索整合子介導(dǎo)肺炎克雷伯菌耐藥性的形成和播散的分子機制,為臨床合理使用抗菌藥物和預(yù)防耐藥性播散提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

收集2002年～2007年間從溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床送檢的體液(如血液、腹水等)、分泌物(如痰液、膿液等),分離得到179株隨機留取的肺炎克雷伯菌。所有菌株都經(jīng)過生物梅里埃公司VITEK-32全自動微生物分析鑒定系統(tǒng)鑒定。其中分離自2006年的肺炎克雷伯菌454(攜帶dhfr17-orfF-aadA2基因盒)用于基因盒攜帶耐藥性基因活性的研究。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性試驗

采用紙片擴散法(K-B法,含藥紙片購自中國藥品生物制品檢定所)檢測肺炎克雷伯菌對氨芐西林(AMP)、哌拉西林(PIP)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)等14種抗菌藥物的敏感性,參照CLSI2008標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果,質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922。

采用平板稀釋法測定細菌的最低抑菌濃度(MIC)[5]：將不同藥物按要求用無菌水等溶劑稀釋后,用冷卻至55℃～60℃的M-H培養(yǎng)基(美國DIFCO公司)配制系列倍比濃度的含藥平板;將待測菌用無菌生理鹽水配制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?取2μL點種于含抗菌藥物平板,以不含藥的M-H平板為對照,ATCC25922為質(zhì)控菌株。接種順序為先接種不含藥對照平板,而后依次從低藥物濃度到高藥物濃度平板,待菌液被瓊脂吸收后,把M-H平板倒置放入35℃±2℃孵箱孵育20～24 h,觀察結(jié)果。采用CLSI2011藥敏試驗操作標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果,試驗平板上無細菌生長的藥物濃度為MIC的終點。

1.2.2 PCR擴增整合酶基因及整合子可變區(qū)

按照AxyPrep試劑盒提取基因組DNA,用primer 5設(shè)計引物(表1)。50μL PCR 反應(yīng)體系：10×Buffer 5 μL,Mg2+(25 mmol/L)3 μL,dNTP(2.5 mmol/L)3μL,上、下游引物(5μmol/L)各 1μL,模板3μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL,購自 TaKaRa公司)0.2μL,用ddH2O 補足至50μL。擴增整合子循環(huán)參數(shù)：95℃變性5 min;95℃ 50 s,55℃ 40 s,72℃3 min,35個循環(huán);72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)(SynGene公司)拍照分析。

1.2.3 測序

采用Perkin-Elmer公司的ABI PRISM Model 3730型全自動測序儀進行PCR產(chǎn)物、克隆基因等的測序(由上海桑尼生物科技有限公司完成)。

1.2.4 序列的注釋

利用ORPHEUS和glimmer程序進行開放閱讀框(Open Reading Frames,ORFs)預(yù)測。RBSFINDER(www.tigr.org/software)用來確定ORF起始密碼子的位置。對于預(yù)測的大于30個氨基酸的ORFs的功能注釋分別用Blastp搜索非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫nr庫、直系同源簇數(shù)據(jù)庫COG和NCBI的CDD(Conserved Domain Database)。注釋過程中如發(fā)現(xiàn)有移碼(shift frame)或者提前出現(xiàn)終止密碼子的則通過人工校正或者重新測序來確認。

1.2.5 整合子攜帶基因的功能分析

根據(jù)注釋結(jié)果,選擇含有已知功能基因和未知功能ORF(orf F)的整合子進行克隆表達。用在線軟件primer5.0設(shè)計相應(yīng)的引物(表1),將PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體,PCR和雙酶切鑒定后送測序。測序正確的片段用BamHⅠ和XhoⅡ雙酶切,純化后克隆到表達載體pET28a,轉(zhuǎn)化到宿主菌E.coliBL21,在LB平板(含Km)上篩選陽性克隆,具體操作參考分子克隆實驗指南[6]進行。提取質(zhì)粒雙酶切驗證后,陽性重組子用IPTG進行誘導(dǎo)表達。以E.coliBL21-pET28a為對照,將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌液及對照菌液適當(dāng)稀釋后,進行平板稀釋法測定對復(fù)方新諾明(含甲氧芐氨嘧啶)、鏈霉素等藥物的最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件,Fisher精確概率法,進行Ⅰ類整合子陽性菌株和陰性菌株對14種藥物及不同年份等的耐藥率進行比較,以P<0.01表示有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗結(jié)果

179株不同來源的臨床分離肺炎克雷伯菌對14種抗菌藥物的敏感性結(jié)果見表2和表3。所有菌株均具有耐藥性,其中118株(65.9%)表現(xiàn)出對至少兩種以上的抗菌藥物耐藥,有79株(44.1%)對4種以上抗菌藥物耐藥,主要為β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類抗菌藥物。對氨芐西林的耐藥率最高(71.2%),對泰能的耐藥率較低(2.4%,表2)。2002～2007年間的回顧性資料分析顯示,在2002～2006年間,對于哌拉西林、頭孢他啶、慶大霉素、復(fù)方新諾明的耐藥率升高,但是到2007年略有下降;相反,對妥布霉素、左旋氧氟沙星等耐藥性在2007年卻有所升高,這可能與近年這些抗菌藥物使用量的迅速增高有關(guān),有資料顯示,左旋氧氟沙星是喹諾酮類中使用量最大的藥物[7]。另外,抗菌藥物在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的濫用也可能是細菌耐藥性迅速增長的重要原因。

表1 引物序列

表2 179株肺炎克雷伯菌耐藥性與Ⅰ類整合子相關(guān)性分析

2.2 整合子檢測結(jié)果及其與耐藥性的相關(guān)性分析

在179株肺炎克雷伯菌中,共有65株菌檢出單條或者雙條Ⅰ類整合子基因盒陽性條帶(陽性率為36.3%),陽性條帶的大小分別約為0.75 kb、1.0 kb、1.5 kb、1.7 kb、2.2 kb、3.0 kb,絕大多數(shù)(46/65,70.7%)為1.7 kb條帶,8株菌(12.3%)檢出2條帶,有4種不同條帶大小的組合(0.75/1.0 kb、0.75/1.7 kb、1.0/1.7 kb和1.5/2.2 kb)。不同標(biāo)本來源病原菌的整合子陽性率及對各種藥物的耐藥率沒有顯著差異(P>0.01,表3)。對不同年份分離的肺炎克雷伯菌整合子陽性率的分析發(fā)現(xiàn),2002～2005年間整合子陽性率呈上升趨勢,2005年最高,2006年和2007年則逐年下降(P<0.01,表4)。整合子陽性組與陰性組的耐藥率除5種藥物(包括氨基糖苷類的丁胺卡那霉素和慶大霉素、喹諾酮類的環(huán)丙沙星和左旋氧氟沙星及復(fù)方新諾明)的耐藥性存在顯著性差異外,其余9種藥物差異不顯著(表2)。

2.3 基因盒的結(jié)構(gòu)分析

整合子全可變區(qū)測序結(jié)果顯示,整合子攜帶的耐藥性基因主要有二氫葉酸還原酶基因(dfr A1、dfr A5、dfr A12、dfr A14、dfr A15、dfr A17)、氨基糖苷腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶基因(aadA、aadA2、aac(6’)、aadA5)、氨基糖苷腺核苷轉(zhuǎn)移酶基因(ant(3’)-I和atn(3’)-Ih)和氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因(cmlA6),編碼細菌對甲氧芐啶類、氨基糖苷類和氯霉素等抗菌藥物的耐藥性,個別整合子還含有功能未知的orfF,整合子可變區(qū)的基因盒包含1～3個耐藥性基因(圖1,表5)。值得一提的是,在本批肺炎克雷伯菌中,攜帶2個耐藥性基因dfr A17-aadA5基因盒的整合子最為多見,占所有整合子的一半(37/73),該基因組合編碼對甲氧芐啶、鏈霉素和壯觀霉素的耐藥性。

2.4 整合子攜帶耐藥性基因的功能驗證

對一株攜帶dhfr17-orfF-aadA2基因的整合子基因盒進行了分段克隆和耐藥性功能測定。首先將這個基因盒的分段 PCR產(chǎn)物(分別包含d hfr 17、dhfr17-orfF、dhfr17-orfF-aad A2基因)各自克隆入p UC18-T載體,插入片段經(jīng)測序驗證后再克隆入pET28a原核表達載體,得到含有目的基因的重組表達載體pET28a-dhfr17、pET28a-dhfr17-orfF和pET28a-dhfr17-orfF-aadA2;然后將重組表達載體轉(zhuǎn)化至E.coliBL21,得到轉(zhuǎn)化子并進行耐藥基因盒相關(guān)的耐藥基因的藥物敏感性測定。MIC實驗分析發(fā)現(xiàn),陽性重組菌株與受體菌E.coliBL21相比較,3個重組子對復(fù)方新諾明(含甲氧芐氨嘧啶)的抗性均由8μg/mL上升到256μg/mL;重組子pET28a-dhfr17-orfF與重組子pET28a-dhfr17對鏈霉素的抗性無明顯變化(和受體菌E.coliBL2一樣均為8μg/mL),而pET28a-dhfr17-orfF-aadA2對鏈霉素的 MIC值為256 μg/mL(表 6)。

表3 179株不同來源肺炎克雷伯菌整合子陽性率(%)及耐藥率(%)

表4 不同年份肺炎克雷伯氏桿菌Ⅰ型可移動整合子的檢出率

2.5 一株肺炎克雷伯菌耐藥性質(zhì)粒攜帶的整合子結(jié)構(gòu)分析

對肺炎克雷伯菌KF3大質(zhì)粒pKF3-140(NC_013951)的序列分析發(fā)現(xiàn),該質(zhì)粒共攜帶8個耐藥性基因,其中2個耐藥性基因(二氫葉酸還原酶基因dfr和鏈霉素腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因aadA)同處于一整合子可變區(qū)內(nèi)(圖2)。pKF3-140為可接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒[8],因此,整合子攜帶的耐藥性基因可隨質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致病原菌的耐藥性播散。

3 討論

整合子是近年來細菌耐藥性形成機制研究的熱點。整合子是一種可攜帶多種功能基因可移動的DNA元件,根據(jù)整合子5′整合酶基因序列的差異,可將它們分為9類,其中I類整合子在病原菌中最為常見[9]。在整合酶的作用下,整合子可捕獲耐藥性基因(如耐氨基糖苷類、氯霉素和甲氧芐胺嘧啶等抗菌藥物基因),并通過質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等可移動DNA元件在同種和不同種屬細菌之間進行轉(zhuǎn)移,引起耐藥性播散[10]。

圖1Ⅰ類整合子15種基因盒的結(jié)構(gòu)示意圖

表5Ⅰ類整合子15種不同結(jié)構(gòu)基因盒的檢出率

表6 重組菌株MIC測定結(jié)果

病原菌的整合子陽性率在不同菌群的陽性率不同[11～13],也有報道顯示,雖然在某些病原菌中整合酶基因的檢出率可達57%,但是整合子基因盒的檢出率只有31.8%[14]。本文在179株臨床分離的肺炎克雷伯菌中共有65株菌檢出單條或者雙條基因盒陽性條帶,陽性率為36.3%。造成各地區(qū)整合子檢出率不同的原因可能與整合子在不同地區(qū)的播散速度差異有關(guān);另外,由于檢測整合子的引物是根據(jù)被擴增的可變區(qū)兩側(cè)的保守序列而設(shè)計的,如果設(shè)計引物區(qū)域發(fā)生了DNA序列的突變或缺失,造成整合子的漏檢。本文研究結(jié)果還顯示,溫州地區(qū)不同年份臨床分離肺炎克雷伯菌整合子陽性率有顯著差異,以2005年最高(達65.3%),之后(2006年和2007年)則逐年下降,造成這種現(xiàn)象的原因有待進一步分析。

本文整合子的基因盒共有15種耐藥基因構(gòu)成形式,其中dfr A17-aadA5是本批肺炎克雷伯菌中最為流行的一種基因盒。最早被鑒定的含有dfr A17-aadA5基因盒的整合子定位于一株分離自澳大利亞的大腸埃希菌染色體上[15],后來在臺灣發(fā)現(xiàn)了編碼dfr A17-aadA5同源基因盒整合子的可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒[16]。本文的dfr A17-aadA5基因盒經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)與表皮葡萄球菌(注冊號：AB291061)及肺炎克雷伯菌(注冊號：AY994155)的dfrA17-aadA5有較高的同源性(達99.8%)。dfr A1、dfr A12、dfr A14和dfr A15等為編碼二氫葉酸還原酶基因,介導(dǎo)對甲氧磺胺嘧啶類的耐藥性,這些基因盒曾在沙門氏菌、大腸埃希菌等中檢出[17]。cmlA6編碼氯霉素外排泵蛋白,介導(dǎo)對氯霉素的耐藥性,常與aadA一起出現(xiàn)[18],本文的cmlA6基因也與aadA組合,構(gòu)成基因盒,該基因盒與大腸埃希菌DQ836058的I類整合子攜帶的同類基因盒的同源性達99%。aadA、aadA2、ant(3’)-I等均在其他病原菌如大腸埃希菌AJ419169、鮑曼不動桿菌EU977568I中檢出,同源性達100%。從以上結(jié)果可以看出,同一耐藥基因盒可以出現(xiàn)在不同的革蘭陰性菌種中,同一菌種中也可以存在多種耐藥基因盒。

圖2 肺炎克雷伯菌KF3質(zhì)粒p KF3-140的整合子區(qū)域結(jié)構(gòu)圖

本文I類整合子的基因盒中,氨基糖苷類和甲氧芐啶類的耐藥基因盒在數(shù)量上占優(yōu)勢,與許多研究報道的結(jié)果相一致[19～21],出現(xiàn)此種現(xiàn)象的原因,可能是目前鏈霉素和壯觀霉素在農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)飼養(yǎng)中被廣泛使用,人類通過接觸動物和食物鏈而獲得攜帶耐鏈霉素、壯觀霉素抗性基因細菌[22],或是二者抗性基因與其他臨床常用藥物的抗性基因一起,共同存在于耐藥性質(zhì)粒而得以長期存在[21]。甲氧芐啶耐藥基因盒整合子的高檢出率,也可能是甲氧芐啶在泌尿道感染的治療中,作為一線藥物被使用[23],造成了泌尿道感染相關(guān)耐藥性菌株的流行。整合子陽性菌株與陰性菌株對多種抗菌藥物的耐藥率有顯著差異,主要集中在氨基糖苷類、喹諾酮類和磺胺類的耐藥,且與整合子基因盒的編碼基因類型(如已檢測到的氨基糖苷類和磺胺類耐藥基因)較為一致,說明整合子參與了肺炎克雷伯菌的耐藥性的形成。

另外,我們對整合子攜帶的已知功能耐藥性基因(dhfr17和aadA2)和未知功能的orfF進行了克隆表達,旨在研究已知功能耐藥性基因的活性以及orfF與耐藥性的相關(guān)性。根據(jù)3種含不同基因組合的重組子對復(fù)方新諾明(含甲氧芐氨嘧啶)和鏈霉素的MIC值可以看出,含有orfF的重組子與不含orfF的重組子在藥物的抗性上并無差異,由此推測orfF與dhfr17或aadA2對抗菌藥物的抗性可能沒有直接的關(guān)系,但其是否具有其他功能仍有待進一步分析鑒定。

整合子是耐藥基因播散的重要機制,耐藥菌可通過整合子將耐藥性相關(guān)基因傳遞給其他細菌,同時還能接受其他細菌的耐藥基因[9]。整合子本身是相對比較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),但位于質(zhì)粒上的整合子可隨質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移而轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致其所攜帶的耐藥性基因在細菌間的相互傳播,大大加快了耐藥性傳播的速度,整合子的水平轉(zhuǎn)移是細菌獲得耐藥基因的重要來源。通過分析一株多重耐藥肺炎克雷伯菌KF3所攜帶的3個質(zhì)粒DNA序列,發(fā)現(xiàn)其中的可接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pKF3-140攜帶一個I類整合子,該整合子可變區(qū)編碼了2個耐藥性基因(二氫葉酸還原酶基因和鏈霉素腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因)[8,24],證實了肺炎克雷伯菌的I類整合子可由質(zhì)粒攜帶,并隨質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致耐藥性播散。

抗生素在臨床、農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的大量應(yīng)用,是細菌耐藥性形成的最重要原因。對整合子的結(jié)構(gòu)及其攜帶的耐藥性基因的研究,有助于揭示細菌耐藥性形成的分子基礎(chǔ),可為制定抗菌藥物使用的相關(guān)政策、合理使用抗菌藥物和控制細菌耐藥性發(fā)展提供幫助。

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