張璠等

摘要：利用細(xì)菌16S rDNA PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)，對(duì)蝦夷馬糞海膽不同腸道的微生物菌群組成進(jìn)行分析，結(jié)果表明：海膽小腸與大腸樣品分別得到14條與13條條帶，其中，共有條帶為10條，優(yōu)勢(shì)條帶分別為7條與5條，特異性條帶分別為4條與3條；經(jīng)后續(xù)條帶比較分析和DGGE圖譜割膠測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，小腸與大腸樣品中微生物主要來源于外界海水環(huán)境，其菌群構(gòu)成存在差異與蝦夷馬糞海膽消化巨藻存在不同有關(guān)。

關(guān)鍵詞：蝦夷馬糞海膽；腸道；16S rDNA；PCR-DGGE指紋圖譜

中圖分類號(hào)： S917.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0043-02

收稿日期：2013-11-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家“863”計(jì)劃 （編號(hào)：2012AA052103）；天津市科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：12ZCZDSFO2000、12ZCZDSY12300）。

作者簡(jiǎn)介：張璠（1989—），女，天津人，碩士，從事獸醫(yī)微生物研究。E-mail：532637158@qq.com。

通信作者：李德茂。E-mail：zhangfan89@163.com。近年來，隨著化石燃料資源日趨減少及空氣污染問題逐漸加重，可再生能源已成為世界研究熱點(diǎn)。藻類具有資源豐富、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)勢(shì)，是一種重要的潛在生物質(zhì)能源資源[1]；但是，藻類細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜且難以降解[2]，大大阻礙了藻類胞內(nèi)生物能向化學(xué)能的轉(zhuǎn)變[3]，因此生產(chǎn)中迫切需要一種成本低廉且高效降解巨藻的方法。蝦夷馬糞海膽（Strongylocentyotus internedius）喜食藻類，可利用腸道微生物水解酶來水解結(jié)構(gòu)致密且多層的藻類細(xì)胞壁，達(dá)到釋放藻類細(xì)胞內(nèi)容物并吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的目的[4]，這類生物降解一般需要多種微生物協(xié)同完成，絕非一個(gè)簡(jiǎn)單過程。蝦夷馬糞海膽腸道結(jié)構(gòu)復(fù)雜，緊貼于體腔壁難以剝離，因此關(guān)于其腸道中微生物構(gòu)成及功能的研究甚少[5]。本試驗(yàn)采用PCR-DGGE技術(shù)，以16S rDNA作為分子標(biāo)記，對(duì)海膽不同腸道的微生物菌群組成進(jìn)行分析，探究不同海膽腸道微生物在巨藻（Macrocystis pyrifera）消化過程中的關(guān)系，為海膽腸道菌群動(dòng)態(tài)研究，以及體外模擬海膽腸道微生物降解巨藻以提高其胞內(nèi)物質(zhì)的化學(xué)能利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料蝦夷馬糞海膽購(gòu)買于大連太平洋海珍品有限公司；巨藻采購(gòu)于青島明月海藻集團(tuán)有限公司。

1.1.2主要試劑 TIANamp Stool DNA Kit，由天根生化科技有限公司生產(chǎn)；UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒，由上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)；大量DNA產(chǎn)物純化試劑盒，由天根生化科技有限公司生產(chǎn)。

1.2樣品的處理

取形態(tài)大小正常且均一的健康海膽10只，在超凈工作臺(tái)上用70%乙醇清洗海膽表面3次；使用無(wú)菌剪刀由海膽排泄孔方向環(huán)形剪開，用手術(shù)刀輕輕剝離海膽性腺與內(nèi)臟，將腸道完全剝離到無(wú)菌的工作盤中并清楚分段；取小腸液與大腸中的食物殘?jiān)?，裝入2 mL無(wú)菌離心管中備用。

1.3腸道DNA的提取

使用TIANamp Stool DNA Kit提取海膽大腸微生物DNA。

1.416S rDNA V3區(qū)的擴(kuò)增

1.5DGGE指紋圖譜的構(gòu)建

使用D Code 2000 System（Bio-Rad）進(jìn)行PCR-DGGE電泳。變性凝膠制備電泳條件為：10%聚丙烯酰胺，濃度范圍在30%～55%；上樣量為20 μL，電壓65 V，溫度60 ℃，電泳時(shí)間16 h。染色方法為銀染。

2結(jié)果與分析

2.1海膽腸道中細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增

將從海膽大腸、小腸中提取的微生物總DNA進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增，在230 bp左右處可見清晰且單一的條帶（圖1）。這表明經(jīng)擴(kuò)增后的16S rDNA V3區(qū)片段純度符合PCR-DGGE要求，可以利用16S rDNA V3區(qū)片段作為分子標(biāo)記構(gòu)建DGGE圖譜。

2.216S rDNA V3區(qū)DGGE指紋圖譜的構(gòu)建與海膽腸內(nèi)細(xì)菌組成分析

由圖2、表1可見，海膽小腸與大腸樣品細(xì)菌總DNA由16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增后經(jīng)PCR-DGGE電泳， 分別得到14條

與13條條帶，兩者條帶總數(shù)較為單一；海膽小腸樣品優(yōu)勢(shì)條帶為7條，分別為X1～X4、X7、X10和X14，其中，5種為海洋嗜冷單胞菌屬（Psychromonas sp.）細(xì)菌，2種為希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）細(xì)菌；大腸樣品優(yōu)勢(shì)條帶為5條，分別為 D1～D4、D12，其中，4種屬于嗜冷單胞菌屬細(xì)菌，1種為希瓦氏菌屬細(xì)菌；海膽小腸與大腸中特異性條帶分別為X5～X7、X9和D5、D6、D9，其中，小腸中3個(gè)條帶為海洋嗜冷單胞菌屬菌，1個(gè)為希瓦氏菌屬菌，而大腸中特異條帶均為希瓦氏菌

屬菌。這說明海膽不同腸道中微生物類群組成存在差異。表1小腸DGGE條帶聚類分析結(jié)果

部位條帶號(hào)細(xì)菌種類相似度（%）登錄號(hào)小腸X1～X5、X8、X9、X14海洋嗜冷單胞菌屬（Psychromonas sp.）94～97NC_020802.1X6非培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured bacterium）——X7、X10～X13希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）100NC_008577.1大腸D1～D4、D7、D13 海洋嗜冷單胞菌屬（Psychromonas sp.）94～98NC_020802.1D5、D6、D8～D12希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）99NC_008577.1

3結(jié)論與討論

海膽體腔為一個(gè)相對(duì)密閉的空間，正常海膽體內(nèi)微生物數(shù)量遠(yuǎn)少于外界環(huán)境[6]，同時(shí)，PCR-DGGE過程存在技術(shù)限制，不同微生物DNA可能會(huì)發(fā)生條帶共遷移，低豐度的菌群較難檢測(cè)出來[7]，造成DGGE圖譜條帶數(shù)量較少。這一現(xiàn)象與蝦夷馬糞海膽體腔中微生物研究結(jié)果較為相似。

海洋嗜冷單胞菌屬微生物在海水中普遍存在，可分泌嗜冷酶[8]，這類酶最適反應(yīng)溫度較低，可長(zhǎng)時(shí)間維持穩(wěn)定的活性且作用廣泛。目前，已從海水中分離出具纖維素酶與脂肪酶活性的嗜冷酶[9]，而纖維素與脂肪同樣也是巨藻的主要營(yíng)養(yǎng)成分[10]。蝦夷馬糞海膽中海洋嗜冷單胞菌屬微生物的出現(xiàn)，在一定程度上也說明海洋嗜冷單胞菌屬微生物在海膽消化巨藻過程中起到不可忽略的作用。希瓦氏菌屬微生物常在皺紋鮑及海蝦等海洋生物中被發(fā)現(xiàn)[11-12]，該菌屬中某些細(xì)菌可分泌多糖類與多不飽和脂肪酸等物質(zhì)，為海洋生物提供營(yíng)養(yǎng)[13]，并在海洋動(dòng)物生長(zhǎng)過程中與腸道內(nèi)的有害微生物形成拮抗關(guān)系[14]，起到抑制病原菌生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力的作用。因此，從試驗(yàn)結(jié)論看，海膽腸道菌中的海洋嗜冷單胞菌屬和希瓦氏菌屬菌有可能來源于海洋環(huán)境，并在海膽消化巨藻及生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到重要作用。

海膽腸道中，小腸優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量比大腸豐富，這可能是由于在海膽消化過程中，食物首先經(jīng)過小腸，造成大部分附著在食物上的微生物隨之進(jìn)入小腸所致。在試驗(yàn)過程中，某些小腸樣品DGGE圖譜條帶在大腸樣品中觀測(cè)不到，這一結(jié)果與海參腸道的研究[15]相似，這也說明了海膽腸道對(duì)微生物具有一定的選擇調(diào)節(jié)作用。另外，小腸中的海洋嗜冷單胞菌屬菌相對(duì)大腸來說，為主要的特異菌群，其對(duì)巨藻的降解能力較強(qiáng)，可能對(duì)巨藻前期消化起到一定作用；大腸中的特異菌群為希瓦氏菌屬菌，可有效幫助海膽體進(jìn)一步吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并抑制大腸中有害微生物的產(chǎn)生。

總之，海膽腸道微生物是在進(jìn)食過程獲得，通過機(jī)體自身作用對(duì)腸道微生物進(jìn)行選擇與調(diào)節(jié)達(dá)到菌群的動(dòng)態(tài)平衡，并利用相對(duì)密閉的體腔空間來維持腸道內(nèi)微生物數(shù)量的穩(wěn)定。在海膽消化過程中，不同腸道中的微生物消化分工有所不同，小腸中海洋嗜冷單胞菌屬菌對(duì)巨藻進(jìn)行前期消化，大腸希瓦氏菌屬菌對(duì)巨藻營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行吸收調(diào)節(jié)。海膽腸道中微生物群類差異與海膽腸道功能密切相關(guān)，其優(yōu)勢(shì)微生物差異性將是了解海膽攝食、揭示腸道微生物協(xié)同降解巨藻機(jī)理的關(guān)鍵所在。

參考文獻(xiàn)：

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[15]孫奕，陳騳. 刺參體內(nèi)外微生物組成及其生理特性的研究[J]. 海洋與湖沼，1989，20（4）：300-307.李曉君，王紹梅，謝艷蘭，等. 農(nóng)桿菌滲透法轉(zhuǎn)化煙草條件的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）

：45-47.

海洋嗜冷單胞菌屬微生物在海水中普遍存在，可分泌嗜冷酶[8]，這類酶最適反應(yīng)溫度較低，可長(zhǎng)時(shí)間維持穩(wěn)定的活性且作用廣泛。目前，已從海水中分離出具纖維素酶與脂肪酶活性的嗜冷酶[9]，而纖維素與脂肪同樣也是巨藻的主要營(yíng)養(yǎng)成分[10]。蝦夷馬糞海膽中海洋嗜冷單胞菌屬微生物的出現(xiàn)，在一定程度上也說明海洋嗜冷單胞菌屬微生物在海膽消化巨藻過程中起到不可忽略的作用。希瓦氏菌屬微生物常在皺紋鮑及海蝦等海洋生物中被發(fā)現(xiàn)[11-12]，該菌屬中某些細(xì)菌可分泌多糖類與多不飽和脂肪酸等物質(zhì)，為海洋生物提供營(yíng)養(yǎng)[13]，并在海洋動(dòng)物生長(zhǎng)過程中與腸道內(nèi)的有害微生物形成拮抗關(guān)系[14]，起到抑制病原菌生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力的作用。因此，從試驗(yàn)結(jié)論看，海膽腸道菌中的海洋嗜冷單胞菌屬和希瓦氏菌屬菌有可能來源于海洋環(huán)境，并在海膽消化巨藻及生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到重要作用。

海膽腸道中，小腸優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量比大腸豐富，這可能是由于在海膽消化過程中，食物首先經(jīng)過小腸，造成大部分附著在食物上的微生物隨之進(jìn)入小腸所致。在試驗(yàn)過程中，某些小腸樣品DGGE圖譜條帶在大腸樣品中觀測(cè)不到，這一結(jié)果與海參腸道的研究[15]相似，這也說明了海膽腸道對(duì)微生物具有一定的選擇調(diào)節(jié)作用。另外，小腸中的海洋嗜冷單胞菌屬菌相對(duì)大腸來說，為主要的特異菌群，其對(duì)巨藻的降解能力較強(qiáng)，可能對(duì)巨藻前期消化起到一定作用；大腸中的特異菌群為希瓦氏菌屬菌，可有效幫助海膽體進(jìn)一步吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并抑制大腸中有害微生物的產(chǎn)生。

總之，海膽腸道微生物是在進(jìn)食過程獲得，通過機(jī)體自身作用對(duì)腸道微生物進(jìn)行選擇與調(diào)節(jié)達(dá)到菌群的動(dòng)態(tài)平衡，并利用相對(duì)密閉的體腔空間來維持腸道內(nèi)微生物數(shù)量的穩(wěn)定。在海膽消化過程中，不同腸道中的微生物消化分工有所不同，小腸中海洋嗜冷單胞菌屬菌對(duì)巨藻進(jìn)行前期消化，大腸希瓦氏菌屬菌對(duì)巨藻營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行吸收調(diào)節(jié)。海膽腸道中微生物群類差異與海膽腸道功能密切相關(guān)，其優(yōu)勢(shì)微生物差異性將是了解海膽攝食、揭示腸道微生物協(xié)同降解巨藻機(jī)理的關(guān)鍵所在。

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[15]孫奕，陳騳. 刺參體內(nèi)外微生物組成及其生理特性的研究[J]. 海洋與湖沼，1989，20（4）：300-307.李曉君，王紹梅，謝艷蘭，等. 農(nóng)桿菌滲透法轉(zhuǎn)化煙草條件的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）

：45-47.

海洋嗜冷單胞菌屬微生物在海水中普遍存在，可分泌嗜冷酶[8]，這類酶最適反應(yīng)溫度較低，可長(zhǎng)時(shí)間維持穩(wěn)定的活性且作用廣泛。目前，已從海水中分離出具纖維素酶與脂肪酶活性的嗜冷酶[9]，而纖維素與脂肪同樣也是巨藻的主要營(yíng)養(yǎng)成分[10]。蝦夷馬糞海膽中海洋嗜冷單胞菌屬微生物的出現(xiàn)，在一定程度上也說明海洋嗜冷單胞菌屬微生物在海膽消化巨藻過程中起到不可忽略的作用。希瓦氏菌屬微生物常在皺紋鮑及海蝦等海洋生物中被發(fā)現(xiàn)[11-12]，該菌屬中某些細(xì)菌可分泌多糖類與多不飽和脂肪酸等物質(zhì)，為海洋生物提供營(yíng)養(yǎng)[13]，并在海洋動(dòng)物生長(zhǎng)過程中與腸道內(nèi)的有害微生物形成拮抗關(guān)系[14]，起到抑制病原菌生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力的作用。因此，從試驗(yàn)結(jié)論看，海膽腸道菌中的海洋嗜冷單胞菌屬和希瓦氏菌屬菌有可能來源于海洋環(huán)境，并在海膽消化巨藻及生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到重要作用。

海膽腸道中，小腸優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量比大腸豐富，這可能是由于在海膽消化過程中，食物首先經(jīng)過小腸，造成大部分附著在食物上的微生物隨之進(jìn)入小腸所致。在試驗(yàn)過程中，某些小腸樣品DGGE圖譜條帶在大腸樣品中觀測(cè)不到，這一結(jié)果與海參腸道的研究[15]相似，這也說明了海膽腸道對(duì)微生物具有一定的選擇調(diào)節(jié)作用。另外，小腸中的海洋嗜冷單胞菌屬菌相對(duì)大腸來說，為主要的特異菌群，其對(duì)巨藻的降解能力較強(qiáng)，可能對(duì)巨藻前期消化起到一定作用；大腸中的特異菌群為希瓦氏菌屬菌，可有效幫助海膽體進(jìn)一步吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并抑制大腸中有害微生物的產(chǎn)生。

總之，海膽腸道微生物是在進(jìn)食過程獲得，通過機(jī)體自身作用對(duì)腸道微生物進(jìn)行選擇與調(diào)節(jié)達(dá)到菌群的動(dòng)態(tài)平衡，并利用相對(duì)密閉的體腔空間來維持腸道內(nèi)微生物數(shù)量的穩(wěn)定。在海膽消化過程中，不同腸道中的微生物消化分工有所不同，小腸中海洋嗜冷單胞菌屬菌對(duì)巨藻進(jìn)行前期消化，大腸希瓦氏菌屬菌對(duì)巨藻營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行吸收調(diào)節(jié)。海膽腸道中微生物群類差異與海膽腸道功能密切相關(guān)，其優(yōu)勢(shì)微生物差異性將是了解海膽攝食、揭示腸道微生物協(xié)同降解巨藻機(jī)理的關(guān)鍵所在。

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