蔣景龍++李麗++王崇英

摘要：以山黧豆（Lathyrus sativus L.）幼苗為試驗(yàn)材料，施加H2O2處理山黧豆初生根，然后檢測(cè)初生根中H2O2含量變化，并采用雙向電泳與質(zhì)譜鑒定技術(shù)，對(duì)初生根中蛋白質(zhì)表達(dá)的變化進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：施加H2O2處理引起了內(nèi)源H2O2水平的產(chǎn)生與積累；利用雙向電泳技術(shù)，共獲得了850～900個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，并檢測(cè)到70個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)，其中43個(gè)蛋白發(fā)生上調(diào)，21個(gè)蛋白發(fā)生下調(diào)，新出現(xiàn)6個(gè)蛋白。對(duì)15個(gè)蛋白點(diǎn)MALDI-TOF-MS/MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，呼吸代謝、蛋白折疊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞防御等方面的蛋白參與了山黧豆初生根對(duì)H2O2的應(yīng)答反應(yīng)。這些蛋白的發(fā)現(xiàn)將有助于進(jìn)一步揭示根對(duì)氧化脅迫的應(yīng)答及H2O2作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞：山黧豆；過氧化氫；初生根；雙向電泳；質(zhì)譜鑒定

中圖分類號(hào)： Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0020-06

收稿日期：2013-12-02

基金項(xiàng)目：陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃（編號(hào)：2014JQ3113）；陜西理工學(xué)院科研基金（博士啟動(dòng)基金）（編號(hào)：SLGQD13-11）。

作者簡(jiǎn)介：蔣景龍（1980—），男，山東棗莊人，博士，講師，主要從事信號(hào)分子H2O2對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆性影響研究。E- mail：jiangjinglong511@163.com。過氧化氫（H2O2）是生物體內(nèi)各種生理代謝的副產(chǎn)物，可以通過有氧代謝過程（如線粒體的呼吸、葉綠體的光合作用和過氧化物酶體）不斷產(chǎn)生，也是活性氧（reactive oxygen species，ROS）中最穩(wěn)定的一種，一直被認(rèn)為是對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的代謝物，在過去的10年里引起了極大的關(guān)注[1]。當(dāng)植物遭受各種各樣的環(huán)境脅迫（如干旱、缺氧、高溫、低溫等）及生物脅迫（如細(xì)菌侵入）時(shí)，H2O2含量迅速升高，脅迫較為嚴(yán)重時(shí)，產(chǎn)生的過量H2O2會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，如引起細(xì)胞膜脂的過氧化、蛋白質(zhì)及核酸的降解、細(xì)胞凋亡甚至死亡[2]。然而，隨著研究的逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)H2O2與其他的ROS分子如超氧陰離子（ O-2· ）、過羥基自由基（HO2·）、單線態(tài)的氧（1O2）或羥自由基（·OH）不同，H2O2屬于非激發(fā)態(tài)的ROS，半衰期很長(zhǎng)，并且不攜帶電荷[3]，因此在生物體內(nèi)H2O2可以作為一種穩(wěn)定的信號(hào)分子，在很多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演重要角色，如誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，參與根的向地性生長(zhǎng)、側(cè)根的發(fā)育、細(xì)胞壁木質(zhì)化、細(xì)胞程序性死亡以及花粉管和柱頭相互作用等[4]，成為了當(dāng)今細(xì)胞與分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。

Joo等的研究表明，H2O2參與了植物根的向地性生長(zhǎng)過程，且H2O2可能是生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)信號(hào)途徑的下游元件[5]。Li等研究發(fā)現(xiàn)，H2O2與生長(zhǎng)素相互作用能夠誘導(dǎo)黃瓜、綠豆的不定根生長(zhǎng)[6-7]。Ishibashi等用H2O2噴施大豆葉片后發(fā)現(xiàn)外源H2O2引起了葉片氣孔的快速關(guān)閉，防止水分過度蒸發(fā)，并誘導(dǎo)了可溶性糖的合成，增強(qiáng)了滲透調(diào)節(jié)能力，從而提高了大豆的干旱抗性[8]。

近幾年，越來越多的研究者開始選擇通過施加外源H2O2的方法來研究它對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響。Wan等用外源H2O2處理水培12 d苗齡的水稻6 h，然后分析水稻葉片生理生化反應(yīng)，并采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究水稻葉片對(duì)H2O2處理引起的蛋白質(zhì)水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了144個(gè)差異表達(dá)的蛋白；對(duì)其中129個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果表明細(xì)胞防御、氧化還原、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白合成與降解、光合、呼吸與糖類和能量代謝方面的蛋白參與了水稻葉片對(duì)H2O2的應(yīng)答[9]。然而，外源H2O2處理水培植物的過程中首先受到氧化脅迫和發(fā)生防御變化的應(yīng)該是根部。因此，本試驗(yàn)采用雙向電泳和質(zhì)譜分析相結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究幼苗期山黧豆的初生根在外源H2O2處理過程中蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，為揭示H2O2的作用機(jī)制及初生根對(duì)H2O2的應(yīng)答反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1植物材料

挑選籽粒飽滿、無(wú)損壞的山黧豆種子，用自來水沖洗3次，播種至潮濕的蛭石中萌發(fā)48 h后，選取長(zhǎng)勢(shì)良好、初生根長(zhǎng)度為2.0～2.5 cm的幼苗作為試驗(yàn)材料。將清洗干凈的幼苗水平放置在盛有50 mL 20 mmol/L H2O2溶液的培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中處理12 h，只加蒸餾水而沒有H2O2的設(shè)為對(duì)照組。每個(gè)培養(yǎng)皿放置10株山黧豆幼苗，每個(gè)處理設(shè)置3～4個(gè)平行組。處理12 h后分別收集H2O2處理組和對(duì)照組幼苗的初生根各4份（每份0.5 g），用錫箔紙包好，-80 ℃冰箱保存。

1.2試驗(yàn)儀器和試劑

1.2.1主要儀器IPGPhor等電聚焦單元，Hoefer SE600垂直電泳單元，MultiTempⅢcooling冷凝單元，Image Scanner高精度掃描儀，LabScan掃描控制和分析前處理軟件，Image Master 2D Platinum Version 5.0雙向凝膠分析軟件（瑞典 Amershanm Pharmacia Biotech公司），4800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer質(zhì)譜檢測(cè)儀器[ABI（Foster City）公司]，Eppendorf 5417C/R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2.2試劑IPG膠條（pH值4～7，18 cm）、碘乙酰銨、硫脲、考馬斯亮藍(lán)R-250、礦物油均購(gòu)自GE 醫(yī)療集團(tuán)。二硫蘇糖醇（DTT）、過硫酸銨（AP）、3-[（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）購(gòu)自Sigma公司。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二銨（TEMED）、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉（SDS）、Tris-堿、二氨基苯胺（DAB）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。丙酮、甲醇、乙酸、甘油、乙酸銨均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1內(nèi)源H2O2的組織化學(xué)定位及含量檢測(cè)山黧豆初生根中的H2O2組織定位與含量的測(cè)定分別參照J(rèn)iang等的DAB（3，3-diaminobenzidine，二氨基苯胺）組織化學(xué)染色法與H2O2測(cè)定的雙酶法[10]。

1.3.2蛋白質(zhì)的提取與定量參照Wu等的TCA-丙酮法[11]提取山黧豆初生根的總蛋白質(zhì)，然后參照Bradford 法[12]進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，蛋白質(zhì)的上樣量為500 μg/凝膠。等點(diǎn)聚焦與第二向SDS-PAGE凝聚電泳操作均參照雙向電泳指導(dǎo)手冊(cè)完成。

1.3.3質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)檢索用掃描儀Image Scanner掃描圖像，分辨率為500 dpi，掃描的圖像比例為1 ∶1。使用Image Master 2D Platinum Version 5.0雙向凝膠分析軟件進(jìn)行凝膠圖像分析。根據(jù)蛋白點(diǎn)的體積和光密度進(jìn)行蛋白質(zhì)的豐度測(cè)定，蛋白點(diǎn)體積與對(duì)照點(diǎn)體積相差大于1.5倍，被視為顯著性差異。經(jīng)過比對(duì)后，取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS/MS蛋白質(zhì)檢測(cè)。質(zhì)譜檢測(cè)詳細(xì)步驟為：（1）膠內(nèi)酶解及Ziptip脫鹽。每個(gè)膠粒切碎后放入EP管中，每管加入200～400 μL 100 mmol/L NH4HCO3/30%ACN脫色，凍干后，加入 5 μL 2.5～10 ng/μL 測(cè)序級(jí)Trypsin （Promega）溶液，37 ℃反應(yīng)過夜；20 h左右后，吸出酶解液，轉(zhuǎn)移至新EP管中，向管中加入100 μL 60% ACN/0.1%TFA，超聲15 min，合并前次溶液，凍干；若有鹽，則用Ziptip（millipore）進(jìn)行脫鹽。（2）質(zhì)譜分析。樣品與5 mg/mL HCCA基質(zhì)1 ∶1混合后，用4800串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（4800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer）進(jìn)行質(zhì)譜分析，激光源為355 nm波長(zhǎng)的Nd：YAG 激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)，PMF質(zhì)量掃描范圍為800～4 000 u，選擇信噪比大于50的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）分析，每個(gè)樣品點(diǎn)上選擇8個(gè)母離子，二級(jí)MS/MS激光激發(fā)2 500次，碰撞能量2 kV，CID關(guān)閉。（3）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。使用以下數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析搜索：數(shù)據(jù)庫(kù)：NCBI；搜索類型：肽指紋圖譜（MS/MS 離子搜索）；鑒定成功標(biāo)準(zhǔn)：蛋白分值C.I.%大于90分。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

測(cè)定的所有指標(biāo)都設(shè)置3個(gè)以上的平行組，以P≤0.05水平作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)測(cè)定的參數(shù)平均值進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1外源H2O2的處理導(dǎo)致山黧豆初生根中內(nèi)源H2O2的積累

由于DAB能夠和H2O2 反應(yīng)生成紅褐色的物質(zhì)，因此通過DAB特異染料染色法分析山黧豆初生根組織內(nèi)的H2O2積累。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)20 mmol/L H2O2處理后山黧豆初生根中染色程度比對(duì)照組（蒸餾水中正常生長(zhǎng)）中山黧豆初生根的染色程度深（圖1），表明外源H2O2處理可能導(dǎo)致了山黧豆初生根內(nèi)源H2O2的積累。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，進(jìn)一步采用雙酶法直接檢測(cè)內(nèi)源H2O2的含量。結(jié)果顯示，未經(jīng)過H2O2處理的山黧豆初生根中內(nèi)源H2O2的水平為0.55 μmol/L，而經(jīng)過H2O2處理的初生根中內(nèi)源H2O2的水平增加至 0.72 μmol/L，表明外源H2O2處理后，內(nèi)源H2O2含量顯著增高（圖2），這一結(jié)果與染色的結(jié)果相符合。

2.2H2O2處理后山黧豆初生根的蛋白圖譜分析

通過雙向電泳技術(shù)對(duì)H2O2處理的山黧豆初生根與對(duì)照組的初生根進(jìn)行全蛋白的提取與分離，獲得了較好重復(fù)性與分辨率較高的電泳圖譜（圖3）。經(jīng)Image Master 2D Platinum Version 5.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，每張2-DE圖譜分離到的蛋白質(zhì)

數(shù)目為（840±67）個(gè)，對(duì)照組與處理組的蛋白點(diǎn)匹配率為862%，相互匹配蛋白數(shù)為818，在蛋白質(zhì)的總數(shù)上沒有明顯變化（圖3-A、圖3-B）。與對(duì)照組相比，70個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生了顯著或極顯著變化，其中上調(diào)蛋白43個(gè)，占總差異表達(dá)蛋白的61. 43%，下調(diào)蛋白21個(gè)，占30%，新出現(xiàn)蛋白點(diǎn)6個(gè)，占8.57%（表1）。這些結(jié)果表明，處理后上調(diào)的蛋白點(diǎn)比例要高于下調(diào)的蛋白點(diǎn)比例。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，新出現(xiàn)的蛋白質(zhì)分子量超過116 ku，等電點(diǎn)靠近7且主要集中在電泳圖譜的a區(qū)，而大部分上調(diào)的蛋白點(diǎn)主要集中在b、d、e區(qū)，下調(diào)的蛋白點(diǎn)主要集中在c區(qū)（圖3-A）。選取差異極顯著（P<0.01）（變化倍率在2倍以上）的15個(gè)蛋白點(diǎn)（其豐度變化如圖3-C）進(jìn)行 MALDI-TOF/MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜分析鑒定。

2.3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定及分析

MALDI-TOF-MS/MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果見表2。表2結(jié)果顯示，除了53、55、57這3個(gè)蛋白點(diǎn)未鑒定成功外，其余的蛋白都被成功鑒定。將蛋白分值C.I.%高于90分的蛋白選擇出來，列于表2中。對(duì)上述鑒定的蛋白點(diǎn)進(jìn)行功能歸類發(fā)現(xiàn)，外源H2O2處理后有5類重要蛋白的表達(dá)發(fā)生了顯著變化。（1）呼吸代謝相關(guān)蛋白。1號(hào)蛋白鑒定結(jié)果為NADH泛醌氧化還原酶亞基（NADH-ubiquinone oxidoreductase subunit），這種蛋白主要定位于線粒體中，為三羧酸循環(huán)的電子傳遞鏈傳遞電子。2號(hào)蛋白為NADH脫氫酶輔酶Q-Fe-S蛋白1-線粒體類似蛋白（NADH dehydrogenase[ubiquinone]iron-sulfur protein 1，mitochondrial-like），它是NADH泛醌氧化還原酶亞基中的一種特殊形式，也在三羧酸循環(huán)過程中發(fā)揮重要的作用。4號(hào)蛋白為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase），存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，在糖異生過程中起催化作用，它能將草酸乙酰轉(zhuǎn)化成磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。23號(hào)蛋白為一種線粒體加工肽酶β亞基類似蛋白（probable mitochondrial-processing peptidase subunit beta-like protein），這種蛋白主要參與了線粒體的呼吸代謝。結(jié)果表明，H2O2處理在山黧豆的初生根中誘導(dǎo)了一系列呼吸代謝和糖異生相關(guān)的蛋白。（2）蛋白折疊相關(guān)蛋白。10、11、66號(hào)蛋白點(diǎn)均為熱激蛋白（heat shock protein），這類蛋白參與了蛋白質(zhì)修飾過程中的蛋白折疊和去折疊，這類蛋白具有多種功能，如參與各種脅迫應(yīng)答、協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊與組裝、參與細(xì)胞防御等。（3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白。經(jīng)過H2O2處理后，40號(hào)蛋白顯著下調(diào)，經(jīng)鑒定這個(gè)蛋白為RanBP1（ran-binding protein 1 homolog b-like），這類蛋白是一類胞質(zhì)Ran結(jié)合蛋白，它能夠抑制RCC1從而刺激GTP從Ran蛋白上釋放出來。Ran是一個(gè)GTP結(jié)合蛋白，它是RNA和蛋白質(zhì)從核孔復(fù)合體中穿過和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中所必需的，同時(shí)，它也控制著DNA的合成與細(xì)胞周期的調(diào)控，主要作為一種調(diào)節(jié)蛋白與膜上的受體蛋白結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。（4）細(xì)胞防御相關(guān)蛋白。51號(hào)蛋白為蛋白酶體的α形式（proteasome subunit alpha type），它的功能是主要清除細(xì)胞內(nèi)的一些多余的肽段，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解與回收。44號(hào)蛋白為鐵蛋白（ferritin），這是一種在細(xì)胞內(nèi)普遍存在的蛋白，它主要是一種鐵離子的蛋白倉(cāng)庫(kù)，調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)的鐵離子含量，并參與了一些離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，去除細(xì)胞內(nèi)多余的鐵離子。（5）貯存蛋白。21號(hào)蛋白為豌豆球蛋白（vicilin），它是豌豆種子中的一種貯存蛋白，這一蛋白在處理的過程中明顯地下調(diào)，表明有可能外源施加過高濃度的H2O2能夠下調(diào)這些貯存蛋白，加速他們的分解，以提供更多的營(yíng)養(yǎng)或者能量。50號(hào)蛋白為區(qū)別豆球蛋白和豌豆球蛋白的第3種貯存蛋白，即convicilin蛋白，這種蛋白已經(jīng)在豌豆中被分離，但是其功能現(xiàn)在還未研究清楚。此外，值得注意的是質(zhì)譜分析結(jié)果表明，這種蛋白主要存在于野豌豆族（如豌豆、山黧豆、兵豆和蠶豆）中。這一蛋白在處理后的初生根中顯著上調(diào)，表明可能起重要作用，而具體作用還需進(jìn)一步研究。

3討論

H2O2扮演雙重角色，一方面作為植物正常代謝中的有毒副產(chǎn)物，另一方面作為在脅迫生理和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)節(jié)性分子；但是目前這2種角色在植物中的轉(zhuǎn)換機(jī)制還不清楚，在H2O2脅迫條件下，植物是如何通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)和抗氧化系統(tǒng)來使植物生存的機(jī)制也還不清楚[9]。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法在蛋白水平比較了H2O2處理及未處理的初生根內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。結(jié)果表明，一些與呼吸作用相關(guān)的蛋白，如NADH泛醌氧化還原酶亞基（NADH-ubiquinone oxidoreductase subunit）、NADH脫氫酶輔酶Q-Fe-S蛋白1-線粒體類似蛋白（NADH dehydrogenase[ubiquinone]iron-sulfur protein 1，mitochondrial-like）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase）只在處理組中表達(dá)，說明外源的H2O2處理導(dǎo)致了一些特異的呼吸代謝作用的出現(xiàn)。NADH泛醌氧化還原酶也稱復(fù)合體Ⅰ，是線粒體呼吸電子傳遞鏈上的第一個(gè)酶體[13]。這表明H2O2脅迫后為了彌補(bǔ)呼吸代謝消耗掉的能量和碳源，這些與呼吸代謝作用和催化糖異生相關(guān)的酶被誘導(dǎo)表達(dá)。存在于細(xì)胞溶質(zhì)中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（簡(jiǎn)稱PEPC），是C4植物光合作用的關(guān)鍵酶，同時(shí)也在植物的各種代謝中發(fā)揮許多重要的功能，如在細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、氣孔開放、氮同化、根系離子吸收、細(xì)胞質(zhì)pH調(diào)節(jié)、光合碳同化等方面發(fā)揮重要作用[14]。在外源H2O2處理后，初生根中誘導(dǎo)表達(dá)的這一蛋白可能與根的離子吸收和根細(xì)胞內(nèi)的pH調(diào)節(jié)有關(guān)。外源H2O2處理也是一種脅迫因子，在正常生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，影響了植物的正常生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理后一些增強(qiáng)氧化脅迫抗性的重要蛋白表現(xiàn)出了上調(diào)，如熱激蛋白（heat shock protein），它是生物體在高溫、鹽漬、寒冷、干旱、饑餓及重金屬離子等環(huán)境脅迫下能夠誘導(dǎo)合成的一類應(yīng)激蛋白，是一種非特異性高度保守的蛋白[15]。逆境脅迫對(duì)細(xì)胞造成的直接傷害包括使蛋白質(zhì)變性而失去正常功能，熱激蛋白作為分子伴侶，在逆境脅迫條件下可以維護(hù)蛋白的功能結(jié)構(gòu)、防止非天然蛋白的集聚、重新折疊變性蛋白以恢復(fù)其功能結(jié)構(gòu)以及清除有潛在危害的變性蛋白等[16]。Wan等研究表明，用外源H2O2處理水培水稻，然后對(duì)葉片的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量的熱激蛋白上調(diào)表達(dá)[9]，這一結(jié)果和本試驗(yàn)結(jié)果相吻合。但是目前還沒有在植物初生根的蛋白質(zhì)組學(xué)中發(fā)現(xiàn)熱激蛋白上調(diào)的報(bào)道。熱激蛋白的表達(dá)增強(qiáng)可能提高了山黧豆初生根對(duì)外源H2O2引起的脅迫抵抗，這也許與熱激蛋白表達(dá)的增強(qiáng)相關(guān)。外源H2O2脅迫有可能引起部分蛋白質(zhì)降解，因此一些參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解與回收的蛋白，如蛋白酶體的α形式（proteasome subunit alpha type）表現(xiàn)出了明顯的上調(diào)。還有一些起到氧化還原和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的蛋白也發(fā)生了明顯的上調(diào)或下調(diào)，如鐵蛋白（ferritin）和RanBP1蛋白。鐵蛋白是一種廣泛存在于生命體中的鐵貯藏蛋白，具有調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝平衡、去除二價(jià)鐵毒性和防止機(jī)體氧化損傷的雙重功能[17]。植物鐵蛋白也能通過降解途徑加速鐵的釋放，與此功能相呼應(yīng)的是鐵蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)被鐵離子濃度和氧化應(yīng)激狀態(tài)調(diào)控。鐵蛋白的表達(dá)在植物中主要受到轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，誘導(dǎo)物是鐵離子和氧化物，在動(dòng)物體內(nèi)主要受到的則是翻譯水平上的調(diào)控，而植物的萌芽和生長(zhǎng)均離不開鐵蛋白鐵的釋放[18]。另外，H2O2處理后還有一些種子中貯存的蛋白，如豌豆球蛋白（vicilin）與convicilin蛋白，也發(fā)生了重要變化，但是這些蛋白的功能還需要進(jìn)一步研究。由于質(zhì)譜分析的蛋白點(diǎn)數(shù)目有限，因此更多的信息還需要在以后的研究中進(jìn)一步挖掘。

3討論

H2O2扮演雙重角色，一方面作為植物正常代謝中的有毒副產(chǎn)物，另一方面作為在脅迫生理和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)節(jié)性分子；但是目前這2種角色在植物中的轉(zhuǎn)換機(jī)制還不清楚，在H2O2脅迫條件下，植物是如何通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)和抗氧化系統(tǒng)來使植物生存的機(jī)制也還不清楚[9]。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法在蛋白水平比較了H2O2處理及未處理的初生根內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。結(jié)果表明，一些與呼吸作用相關(guān)的蛋白，如NADH泛醌氧化還原酶亞基（NADH-ubiquinone oxidoreductase subunit）、NADH脫氫酶輔酶Q-Fe-S蛋白1-線粒體類似蛋白（NADH dehydrogenase[ubiquinone]iron-sulfur protein 1，mitochondrial-like）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase）只在處理組中表達(dá)，說明外源的H2O2處理導(dǎo)致了一些特異的呼吸代謝作用的出現(xiàn)。NADH泛醌氧化還原酶也稱復(fù)合體Ⅰ，是線粒體呼吸電子傳遞鏈上的第一個(gè)酶體[13]。這表明H2O2脅迫后為了彌補(bǔ)呼吸代謝消耗掉的能量和碳源，這些與呼吸代謝作用和催化糖異生相關(guān)的酶被誘導(dǎo)表達(dá)。存在于細(xì)胞溶質(zhì)中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（簡(jiǎn)稱PEPC），是C4植物光合作用的關(guān)鍵酶，同時(shí)也在植物的各種代謝中發(fā)揮許多重要的功能，如在細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、氣孔開放、氮同化、根系離子吸收、細(xì)胞質(zhì)pH調(diào)節(jié)、光合碳同化等方面發(fā)揮重要作用[14]。在外源H2O2處理后，初生根中誘導(dǎo)表達(dá)的這一蛋白可能與根的離子吸收和根細(xì)胞內(nèi)的pH調(diào)節(jié)有關(guān)。外源H2O2處理也是一種脅迫因子，在正常生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，影響了植物的正常生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理后一些增強(qiáng)氧化脅迫抗性的重要蛋白表現(xiàn)出了上調(diào)，如熱激蛋白（heat shock protein），它是生物體在高溫、鹽漬、寒冷、干旱、饑餓及重金屬離子等環(huán)境脅迫下能夠誘導(dǎo)合成的一類應(yīng)激蛋白，是一種非特異性高度保守的蛋白[15]。逆境脅迫對(duì)細(xì)胞造成的直接傷害包括使蛋白質(zhì)變性而失去正常功能，熱激蛋白作為分子伴侶，在逆境脅迫條件下可以維護(hù)蛋白的功能結(jié)構(gòu)、防止非天然蛋白的集聚、重新折疊變性蛋白以恢復(fù)其功能結(jié)構(gòu)以及清除有潛在危害的變性蛋白等[16]。Wan等研究表明，用外源H2O2處理水培水稻，然后對(duì)葉片的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量的熱激蛋白上調(diào)表達(dá)[9]，這一結(jié)果和本試驗(yàn)結(jié)果相吻合。但是目前還沒有在植物初生根的蛋白質(zhì)組學(xué)中發(fā)現(xiàn)熱激蛋白上調(diào)的報(bào)道。熱激蛋白的表達(dá)增強(qiáng)可能提高了山黧豆初生根對(duì)外源H2O2引起的脅迫抵抗，這也許與熱激蛋白表達(dá)的增強(qiáng)相關(guān)。外源H2O2脅迫有可能引起部分蛋白質(zhì)降解，因此一些參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解與回收的蛋白，如蛋白酶體的α形式（proteasome subunit alpha type）表現(xiàn)出了明顯的上調(diào)。還有一些起到氧化還原和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的蛋白也發(fā)生了明顯的上調(diào)或下調(diào)，如鐵蛋白（ferritin）和RanBP1蛋白。鐵蛋白是一種廣泛存在于生命體中的鐵貯藏蛋白，具有調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝平衡、去除二價(jià)鐵毒性和防止機(jī)體氧化損傷的雙重功能[17]。植物鐵蛋白也能通過降解途徑加速鐵的釋放，與此功能相呼應(yīng)的是鐵蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)被鐵離子濃度和氧化應(yīng)激狀態(tài)調(diào)控。鐵蛋白的表達(dá)在植物中主要受到轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，誘導(dǎo)物是鐵離子和氧化物，在動(dòng)物體內(nèi)主要受到的則是翻譯水平上的調(diào)控，而植物的萌芽和生長(zhǎng)均離不開鐵蛋白鐵的釋放[18]。另外，H2O2處理后還有一些種子中貯存的蛋白，如豌豆球蛋白（vicilin）與convicilin蛋白，也發(fā)生了重要變化，但是這些蛋白的功能還需要進(jìn)一步研究。由于質(zhì)譜分析的蛋白點(diǎn)數(shù)目有限，因此更多的信息還需要在以后的研究中進(jìn)一步挖掘。

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H2O2扮演雙重角色，一方面作為植物正常代謝中的有毒副產(chǎn)物，另一方面作為在脅迫生理和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)節(jié)性分子；但是目前這2種角色在植物中的轉(zhuǎn)換機(jī)制還不清楚，在H2O2脅迫條件下，植物是如何通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)和抗氧化系統(tǒng)來使植物生存的機(jī)制也還不清楚[9]。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法在蛋白水平比較了H2O2處理及未處理的初生根內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。結(jié)果表明，一些與呼吸作用相關(guān)的蛋白，如NADH泛醌氧化還原酶亞基（NADH-ubiquinone oxidoreductase subunit）、NADH脫氫酶輔酶Q-Fe-S蛋白1-線粒體類似蛋白（NADH dehydrogenase[ubiquinone]iron-sulfur protein 1，mitochondrial-like）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase）只在處理組中表達(dá)，說明外源的H2O2處理導(dǎo)致了一些特異的呼吸代謝作用的出現(xiàn)。NADH泛醌氧化還原酶也稱復(fù)合體Ⅰ，是線粒體呼吸電子傳遞鏈上的第一個(gè)酶體[13]。這表明H2O2脅迫后為了彌補(bǔ)呼吸代謝消耗掉的能量和碳源，這些與呼吸代謝作用和催化糖異生相關(guān)的酶被誘導(dǎo)表達(dá)。存在于細(xì)胞溶質(zhì)中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（簡(jiǎn)稱PEPC），是C4植物光合作用的關(guān)鍵酶，同時(shí)也在植物的各種代謝中發(fā)揮許多重要的功能，如在細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、氣孔開放、氮同化、根系離子吸收、細(xì)胞質(zhì)pH調(diào)節(jié)、光合碳同化等方面發(fā)揮重要作用[14]。在外源H2O2處理后，初生根中誘導(dǎo)表達(dá)的這一蛋白可能與根的離子吸收和根細(xì)胞內(nèi)的pH調(diào)節(jié)有關(guān)。外源H2O2處理也是一種脅迫因子，在正常生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，影響了植物的正常生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理后一些增強(qiáng)氧化脅迫抗性的重要蛋白表現(xiàn)出了上調(diào)，如熱激蛋白（heat shock protein），它是生物體在高溫、鹽漬、寒冷、干旱、饑餓及重金屬離子等環(huán)境脅迫下能夠誘導(dǎo)合成的一類應(yīng)激蛋白，是一種非特異性高度保守的蛋白[15]。逆境脅迫對(duì)細(xì)胞造成的直接傷害包括使蛋白質(zhì)變性而失去正常功能，熱激蛋白作為分子伴侶，在逆境脅迫條件下可以維護(hù)蛋白的功能結(jié)構(gòu)、防止非天然蛋白的集聚、重新折疊變性蛋白以恢復(fù)其功能結(jié)構(gòu)以及清除有潛在危害的變性蛋白等[16]。Wan等研究表明，用外源H2O2處理水培水稻，然后對(duì)葉片的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量的熱激蛋白上調(diào)表達(dá)[9]，這一結(jié)果和本試驗(yàn)結(jié)果相吻合。但是目前還沒有在植物初生根的蛋白質(zhì)組學(xué)中發(fā)現(xiàn)熱激蛋白上調(diào)的報(bào)道。熱激蛋白的表達(dá)增強(qiáng)可能提高了山黧豆初生根對(duì)外源H2O2引起的脅迫抵抗，這也許與熱激蛋白表達(dá)的增強(qiáng)相關(guān)。外源H2O2脅迫有可能引起部分蛋白質(zhì)降解，因此一些參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解與回收的蛋白，如蛋白酶體的α形式（proteasome subunit alpha type）表現(xiàn)出了明顯的上調(diào)。還有一些起到氧化還原和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的蛋白也發(fā)生了明顯的上調(diào)或下調(diào)，如鐵蛋白（ferritin）和RanBP1蛋白。鐵蛋白是一種廣泛存在于生命體中的鐵貯藏蛋白，具有調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝平衡、去除二價(jià)鐵毒性和防止機(jī)體氧化損傷的雙重功能[17]。植物鐵蛋白也能通過降解途徑加速鐵的釋放，與此功能相呼應(yīng)的是鐵蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)被鐵離子濃度和氧化應(yīng)激狀態(tài)調(diào)控。鐵蛋白的表達(dá)在植物中主要受到轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，誘導(dǎo)物是鐵離子和氧化物，在動(dòng)物體內(nèi)主要受到的則是翻譯水平上的調(diào)控，而植物的萌芽和生長(zhǎng)均離不開鐵蛋白鐵的釋放[18]。另外，H2O2處理后還有一些種子中貯存的蛋白，如豌豆球蛋白（vicilin）與convicilin蛋白，也發(fā)生了重要變化，但是這些蛋白的功能還需要進(jìn)一步研究。由于質(zhì)譜分析的蛋白點(diǎn)數(shù)目有限，因此更多的信息還需要在以后的研究中進(jìn)一步挖掘。