孫聲遠(yuǎn)等

摘要：應(yīng)用酸性染料比色法測(cè)定蝙蝠葛根、莖、葉中總生物堿隨季節(jié)性變化規(guī)律。以蝙蝠葛堿為對(duì)照品，溴甲酚綠為顯色劑，pH4的鄰苯二甲酸氫鉀——?dú)溲趸c為緩沖溶液，在280納米處測(cè)定其各部位吸光度，結(jié)果在1.7～10.2微克/毫升范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為A=0.0783C+0.1839，R2=0.9997（n=6）。平均加樣回收率100.64%，RSD=0.83%。根中總生物堿含量在春季最高后下降再上升；莖中總生物堿含量在6月中旬左右最高，秋季最低；葉中總生物堿含量在春季最高后一直下降。

關(guān)鍵詞：蝙蝠葛；總生物堿；酸性染料比色法

項(xiàng)目支持：吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目

中圖分類(lèi)號(hào)： R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.21.0015

蝙蝠葛（ Menispermum dauricum DC ）為防己科蝙蝠葛屬植物，分布我國(guó)東北、華北地區(qū)及日本、朝鮮、蒙古等國(guó)[1]。其具清熱解毒，祛風(fēng)止痛。用于咽喉腫痛，熱毒瀉痢，風(fēng)濕痹痛[2]。北豆根為其藥用部分，為植物干燥的根莖，北豆根水煎液與流浸膏低劑量具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用[2]。蝙蝠葛堿常溫下比較穩(wěn)定，光照可以引起其降解，應(yīng)避光陰涼處保存[3]。

本文采用蝙蝠葛堿為對(duì)照品，溴甲酚綠為顯色劑，pH4的鄰苯二甲酸氫鉀——?dú)溲趸c為緩沖溶液的紫外分光光度法，以建立蝙蝠葛中總生物堿的含量測(cè)定曲線，確定蝙蝠葛不同部位的總生物堿季節(jié)性變化規(guī)律，為研究和開(kāi)發(fā)蝙蝠葛資源提供質(zhì)量評(píng)價(jià)手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（津島UV-1600，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），SY-360超聲波清洗器（上海寧商超聲儀器有限公司）；TDL-4離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠制造）；蝙蝠葛堿標(biāo)準(zhǔn)品（B-032-130519成都瑞芬思生物科技有限公司）；蝙蝠葛植物采摘于吉林猴石山，經(jīng)鑒定為正品。采摘其根，莖，葉。采集日期分別為5月30日，6月20日，7月15日，8月30日，9月20日（此時(shí)部分葉片已經(jīng)開(kāi)始枯萎）。其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精確稱(chēng)取蝙蝠葛堿標(biāo)準(zhǔn)品8毫克，置25毫升容量瓶中，加無(wú)水乙醇超聲30分鐘溶解定容至刻度，即得濃度為 0.32毫克/毫升 對(duì)照品溶液。

1.2.2 樣品溶液的制備 將蝙蝠葛植物置于50℃干燥，用粉碎機(jī)粉碎，精密稱(chēng)取蝙蝠葛植物根、莖、葉細(xì)粉各0.25克，加1.5%稀硫酸 10毫升 室溫浸泡24小時(shí)，過(guò)濾，取濾液加氫氧化鈉溶液調(diào)pH到9靜止12小時(shí)，離心，取沉淀 50℃干燥，保存。后將各樣品分別溶于10毫升無(wú)水乙醇中，超聲30分鐘，取1毫升加無(wú)水乙醇溶于10毫升容量瓶至刻度。

1.2.3 溴甲酚綠緩沖液的制備 分別配制pH3、pH4、pH5的鄰苯二甲酸氫鉀——?dú)溲趸c緩沖溶液，加入溴甲酚綠0.035克，使其充分溶解，備用。

1.2.4 顯色鑒別 將蝙蝠葛植物根、莖、葉粉末分別用1.5%稀硫酸浸泡12小時(shí)，過(guò)濾，取濾液分成9組分別加入生物堿沉淀劑：碘化鉍鉀、碘化汞鉀、硅鎢酸。如果含有生物堿，加入碘化鉍鉀的溶液將產(chǎn)生橙黃色沉淀；加入碘化汞鉀的溶液將產(chǎn)生白色沉淀，繼續(xù)加入，沉淀溶解；加入硅鎢酸的溶液將產(chǎn)生白色沉淀。

1.2.5 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～700納米波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.6 測(cè)定方法 精密量取對(duì)照品溶液和樣品溶液各2毫升分別置于內(nèi)有15毫升氯仿的分液漏斗中，分別加入溴甲酚綠緩沖液各4毫升，振搖1分鐘，靜置10分鐘，再振搖2次，取氯仿層至容量瓶中，為防止水分對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，對(duì)照品和樣品萃取液都加入無(wú)水硫酸鈉0.1克，以氯仿萃取的溴甲酚綠緩沖液為空白對(duì)照，測(cè)吸收度。

1.2.7 緩沖溶液pH的選擇 按1.2.6方法，取3組相同濃度的對(duì)照品溶液，分別加入pH3、pH4、pH5的溴甲酚綠緩沖溶液4毫升測(cè)量，在最大吸收處比較吸光度數(shù)值，確定吸光度最高處緩沖溶液的pH值，之后均按此pH測(cè)定樣品。

1.2.8 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察。精密量取對(duì)照品溶液1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫升、6毫升分別置于25毫升容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，制成系列濃度的對(duì)照品溶液，各取2毫升按1.2.6的方法測(cè)定，以吸收度（A）為縱坐標(biāo)，蝙蝠葛堿濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

重復(fù)性考察。取同一批同部位蝙蝠葛植物，按1.2.2的方法，平行制備 5 份樣品溶液，按1.2.6的方法測(cè)定，計(jì)算RSD。

精密度考察。取同一樣品溶液，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，按1.2.6的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD。

穩(wěn)定性考察。精密吸取樣品溶液2毫升，對(duì)照品溶液2毫升，按1.2.6的方法分別于0、1、2、6、12小時(shí)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD。

加樣回收率。精密稱(chēng)取5份已知含量的蝙蝠葛堿對(duì)照品溶液2毫升，分別加入精確量取5份已知含量的樣品溶液2毫升；按1.2.6的方法測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

因氯仿的截止波長(zhǎng)在24納米，所以測(cè)量發(fā)現(xiàn)兩溶液在280納米處有最大吸收值。因此，樣品和對(duì)照品溶液均在280納米處測(cè)吸收度。

2.2 緩沖溶液pH的選擇

pH4的緩沖溶液吸光度最高，因此pH4的溴甲酚綠緩沖溶液為最適緩沖溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 回歸方程為：A=0.0783C+0.1839；R2=0.9997，（n=6）結(jié)果表明，在1.7～10.2微克/毫升濃度范圍內(nèi)，蝙蝠葛堿與吸光度呈良好的線性關(guān)系。endprint

2.3.2 重復(fù)性考察 結(jié)果RSD=0.83%（n=5），表明重現(xiàn)性良好。

2.3.3 精密度考察 結(jié)果RSD=0.55%（n=5），表明精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 樣品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，吸光度幾乎不變。RSD=1.03%（n=5），表明樣品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率 平均加樣回收率為100.64%，表明方法準(zhǔn)確。

2.4 樣品含量

按1.2.2和1.2.6方法測(cè)定全年內(nèi)蝙蝠葛不同部位的總生物堿吸光度，將吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出總生物堿含量，結(jié)果如下。

2.4.1 根中總生物堿含量變化 根中總生物堿含量變化見(jiàn)圖1：

圖1 蝙蝠葛根中總生物堿含量變化

從圖1中可以看出：根所含總生物堿含量在春季最高，夏季下降到最低，秋季再上升，但秋季含量較春季偏低一些。

2.4.2 莖中總生物堿含量變化 莖中總生物堿含量變化見(jiàn)圖2：

圖2 蝙蝠葛莖中總生物堿含量變化

從圖2中可以看出：莖所含總生物堿總體呈現(xiàn)上下波動(dòng)狀態(tài)，從春季開(kāi)始逐漸升高到6月20日左右含量最高；之后開(kāi)始下降，到7月中旬含量達(dá)到一個(gè)低谷，接著開(kāi)始上升，到8月末含量達(dá)到一個(gè)新的高峰；之后開(kāi)始下降，秋季含量達(dá)到最低。

2.4.3 葉中總生物堿含量變化 葉中總生物堿含量變化見(jiàn)圖3：

從圖3中可以看出：葉中總生物堿含量在春季最高，之后逐漸下降，到秋季最低。

3 結(jié)語(yǔ)

一是通過(guò)方法學(xué)的研究，可以認(rèn)為本文采用的測(cè)定總生物堿的方法準(zhǔn)確性好，靈敏度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，可用于蝙蝠葛中總生物堿的含量測(cè)定。

二是確定了利用葉中生物堿，應(yīng)該在春季采摘；利用莖中生物堿應(yīng)該在6月中旬采摘；而利用根中生物堿應(yīng)該在春季或秋季采摘。葉中生物堿含量從春節(jié)開(kāi)始逐漸下降，可能與葉的老化，生物堿合成能力降低有關(guān)；莖和根中生物堿含量在7月中旬都比較低，可能因?yàn)闅鉁剌^高，生物堿合成速率降低有關(guān)。

三是目前在植物蝙蝠葛中，只用其干燥根莖入藥，以往文獻(xiàn)大多也只研究根中的生物堿含量、成分、藥理作用等。楊靜偉[4]曾對(duì)北豆根中總生物堿的含量進(jìn)行測(cè)定，并未研究不同季節(jié)根中總生物堿含量變化規(guī)律。于維萍等[5]曾對(duì)不同產(chǎn)地北豆根中蝙蝠葛堿含量進(jìn)行測(cè)定，但所購(gòu)不同地區(qū)的北豆根并不能確定是同一月份采摘，對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性有一定影響，并未研究不同季節(jié)的根中總生物堿含量變化規(guī)律。龔寧[6]曾對(duì)蝙蝠葛莖葉中單一生物堿進(jìn)行研究，但未研究莖葉中總生物堿含量。本文研究了蝙蝠葛不同部位總生物堿含量隨季節(jié)性變化的規(guī)律，說(shuō)明不同采摘月份對(duì)蝙蝠葛總生物堿含量有較大的影響。通過(guò)研究，確定了葉和莖中也含有生物堿，春季葉和莖中總生物堿含量都很高，也可以入藥。因此，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)蝙蝠葛資源提供了質(zhì)量評(píng)價(jià)手段和理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]傅立國(guó)，等.中國(guó)高等植物，第三卷[M].青島：青島出版社，2012：682.

[2]張穎，孫操，關(guān)慶超，等.北豆根抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2009，（06）：367-368.

[3]劉全宇，劉文義.北豆根中蝙蝠葛堿的穩(wěn)定性研究[J].中成藥，2011，（05）：884-886.

[4]楊靜偉，楊晶凡，李二林.紫外分光光度法測(cè)定北豆根總生物堿的含量[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2013，（13）：7-8.

[5]于維萍，傅春升，陶琳璐.HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地北豆根中蝙蝠葛堿的測(cè)定[J].齊魯藥事，2005，24（3）：143-144.

[6]龔寧.蝙蝠葛莖葉中的生物堿研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2001.

作者簡(jiǎn)介：孫聲遠(yuǎn)，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院制藥工程學(xué)院，學(xué)生，研究方向：天然藥物化學(xué)；通訊作者：張克勤，博士，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院制藥工程學(xué)院，教授，研究方向：制藥工程。endprint

2.3.2 重復(fù)性考察 結(jié)果RSD=0.83%（n=5），表明重現(xiàn)性良好。

2.3.3 精密度考察 結(jié)果RSD=0.55%（n=5），表明精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 樣品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，吸光度幾乎不變。RSD=1.03%（n=5），表明樣品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率 平均加樣回收率為100.64%，表明方法準(zhǔn)確。

2.4 樣品含量

按1.2.2和1.2.6方法測(cè)定全年內(nèi)蝙蝠葛不同部位的總生物堿吸光度，將吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出總生物堿含量，結(jié)果如下。

2.4.1 根中總生物堿含量變化 根中總生物堿含量變化見(jiàn)圖1：

圖1 蝙蝠葛根中總生物堿含量變化

從圖1中可以看出：根所含總生物堿含量在春季最高，夏季下降到最低，秋季再上升，但秋季含量較春季偏低一些。

2.4.2 莖中總生物堿含量變化 莖中總生物堿含量變化見(jiàn)圖2：

圖2 蝙蝠葛莖中總生物堿含量變化

從圖2中可以看出：莖所含總生物堿總體呈現(xiàn)上下波動(dòng)狀態(tài)，從春季開(kāi)始逐漸升高到6月20日左右含量最高；之后開(kāi)始下降，到7月中旬含量達(dá)到一個(gè)低谷，接著開(kāi)始上升，到8月末含量達(dá)到一個(gè)新的高峰；之后開(kāi)始下降，秋季含量達(dá)到最低。

2.4.3 葉中總生物堿含量變化 葉中總生物堿含量變化見(jiàn)圖3：

從圖3中可以看出：葉中總生物堿含量在春季最高，之后逐漸下降，到秋季最低。

3 結(jié)語(yǔ)

一是通過(guò)方法學(xué)的研究，可以認(rèn)為本文采用的測(cè)定總生物堿的方法準(zhǔn)確性好，靈敏度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，可用于蝙蝠葛中總生物堿的含量測(cè)定。

二是確定了利用葉中生物堿，應(yīng)該在春季采摘；利用莖中生物堿應(yīng)該在6月中旬采摘；而利用根中生物堿應(yīng)該在春季或秋季采摘。葉中生物堿含量從春節(jié)開(kāi)始逐漸下降，可能與葉的老化，生物堿合成能力降低有關(guān)；莖和根中生物堿含量在7月中旬都比較低，可能因?yàn)闅鉁剌^高，生物堿合成速率降低有關(guān)。

三是目前在植物蝙蝠葛中，只用其干燥根莖入藥，以往文獻(xiàn)大多也只研究根中的生物堿含量、成分、藥理作用等。楊靜偉[4]曾對(duì)北豆根中總生物堿的含量進(jìn)行測(cè)定，并未研究不同季節(jié)根中總生物堿含量變化規(guī)律。于維萍等[5]曾對(duì)不同產(chǎn)地北豆根中蝙蝠葛堿含量進(jìn)行測(cè)定，但所購(gòu)不同地區(qū)的北豆根并不能確定是同一月份采摘，對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性有一定影響，并未研究不同季節(jié)的根中總生物堿含量變化規(guī)律。龔寧[6]曾對(duì)蝙蝠葛莖葉中單一生物堿進(jìn)行研究，但未研究莖葉中總生物堿含量。本文研究了蝙蝠葛不同部位總生物堿含量隨季節(jié)性變化的規(guī)律，說(shuō)明不同采摘月份對(duì)蝙蝠葛總生物堿含量有較大的影響。通過(guò)研究，確定了葉和莖中也含有生物堿，春季葉和莖中總生物堿含量都很高，也可以入藥。因此，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)蝙蝠葛資源提供了質(zhì)量評(píng)價(jià)手段和理論基礎(chǔ)。

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[3]劉全宇，劉文義.北豆根中蝙蝠葛堿的穩(wěn)定性研究[J].中成藥，2011，（05）：884-886.

[4]楊靜偉，楊晶凡，李二林.紫外分光光度法測(cè)定北豆根總生物堿的含量[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2013，（13）：7-8.

[5]于維萍，傅春升，陶琳璐.HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地北豆根中蝙蝠葛堿的測(cè)定[J].齊魯藥事，2005，24（3）：143-144.

[6]龔寧.蝙蝠葛莖葉中的生物堿研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2001.

作者簡(jiǎn)介：孫聲遠(yuǎn)，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院制藥工程學(xué)院，學(xué)生，研究方向：天然藥物化學(xué)；通訊作者：張克勤，博士，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院制藥工程學(xué)院，教授，研究方向：制藥工程。endprint

2.3.2 重復(fù)性考察 結(jié)果RSD=0.83%（n=5），表明重現(xiàn)性良好。

2.3.3 精密度考察 結(jié)果RSD=0.55%（n=5），表明精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 樣品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，吸光度幾乎不變。RSD=1.03%（n=5），表明樣品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率 平均加樣回收率為100.64%，表明方法準(zhǔn)確。

2.4 樣品含量

按1.2.2和1.2.6方法測(cè)定全年內(nèi)蝙蝠葛不同部位的總生物堿吸光度，將吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出總生物堿含量，結(jié)果如下。

2.4.1 根中總生物堿含量變化 根中總生物堿含量變化見(jiàn)圖1：

圖1 蝙蝠葛根中總生物堿含量變化

從圖1中可以看出：根所含總生物堿含量在春季最高，夏季下降到最低，秋季再上升，但秋季含量較春季偏低一些。

2.4.2 莖中總生物堿含量變化 莖中總生物堿含量變化見(jiàn)圖2：

圖2 蝙蝠葛莖中總生物堿含量變化

從圖2中可以看出：莖所含總生物堿總體呈現(xiàn)上下波動(dòng)狀態(tài)，從春季開(kāi)始逐漸升高到6月20日左右含量最高；之后開(kāi)始下降，到7月中旬含量達(dá)到一個(gè)低谷，接著開(kāi)始上升，到8月末含量達(dá)到一個(gè)新的高峰；之后開(kāi)始下降，秋季含量達(dá)到最低。

2.4.3 葉中總生物堿含量變化 葉中總生物堿含量變化見(jiàn)圖3：

從圖3中可以看出：葉中總生物堿含量在春季最高，之后逐漸下降，到秋季最低。

3 結(jié)語(yǔ)

一是通過(guò)方法學(xué)的研究，可以認(rèn)為本文采用的測(cè)定總生物堿的方法準(zhǔn)確性好，靈敏度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，可用于蝙蝠葛中總生物堿的含量測(cè)定。

二是確定了利用葉中生物堿，應(yīng)該在春季采摘；利用莖中生物堿應(yīng)該在6月中旬采摘；而利用根中生物堿應(yīng)該在春季或秋季采摘。葉中生物堿含量從春節(jié)開(kāi)始逐漸下降，可能與葉的老化，生物堿合成能力降低有關(guān)；莖和根中生物堿含量在7月中旬都比較低，可能因?yàn)闅鉁剌^高，生物堿合成速率降低有關(guān)。

三是目前在植物蝙蝠葛中，只用其干燥根莖入藥，以往文獻(xiàn)大多也只研究根中的生物堿含量、成分、藥理作用等。楊靜偉[4]曾對(duì)北豆根中總生物堿的含量進(jìn)行測(cè)定，并未研究不同季節(jié)根中總生物堿含量變化規(guī)律。于維萍等[5]曾對(duì)不同產(chǎn)地北豆根中蝙蝠葛堿含量進(jìn)行測(cè)定，但所購(gòu)不同地區(qū)的北豆根并不能確定是同一月份采摘，對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性有一定影響，并未研究不同季節(jié)的根中總生物堿含量變化規(guī)律。龔寧[6]曾對(duì)蝙蝠葛莖葉中單一生物堿進(jìn)行研究，但未研究莖葉中總生物堿含量。本文研究了蝙蝠葛不同部位總生物堿含量隨季節(jié)性變化的規(guī)律，說(shuō)明不同采摘月份對(duì)蝙蝠葛總生物堿含量有較大的影響。通過(guò)研究，確定了葉和莖中也含有生物堿，春季葉和莖中總生物堿含量都很高，也可以入藥。因此，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)蝙蝠葛資源提供了質(zhì)量評(píng)價(jià)手段和理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]傅立國(guó)，等.中國(guó)高等植物，第三卷[M].青島：青島出版社，2012：682.

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[4]楊靜偉，楊晶凡，李二林.紫外分光光度法測(cè)定北豆根總生物堿的含量[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2013，（13）：7-8.

[5]于維萍，傅春升，陶琳璐.HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地北豆根中蝙蝠葛堿的測(cè)定[J].齊魯藥事，2005，24（3）：143-144.

[6]龔寧.蝙蝠葛莖葉中的生物堿研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2001.

作者簡(jiǎn)介：孫聲遠(yuǎn)，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院制藥工程學(xué)院，學(xué)生，研究方向：天然藥物化學(xué)；通訊作者：張克勤，博士，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院制藥工程學(xué)院，教授，研究方向：制藥工程。endprint