趙明惠 冉 鑫 董言德 郭曉霞 張映梅 邢 丹 吳治明 李春曉** 趙彤言1,**

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥 230032；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071； 3.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004)

淡色庫蚊Culexpipienspallens屬于尖音庫蚊復(fù)合組Culexpipienscomplex(趙彤言和陸寶麟，1994)，是我國主要的家棲蚊種，而且是絲蟲病和乙型腦炎的重要媒介，因此是城市衛(wèi)生殺蟲劑防控的主要對象(何建國等，2011；張金光和霍新北，2011)。但是由于殺蟲劑的長期、大量應(yīng)用，已經(jīng)導(dǎo)致該蚊蟲抗藥性的持續(xù)發(fā)生(Sarkaretal.，2009；劉斯璐等，2011；孟鳳霞等，2011)，蚊蟲抗藥性的產(chǎn)生不僅使城市蚊蟲控制面臨更大的挑戰(zhàn)，同時也對公眾健康產(chǎn)生更大的威脅。

蚊蟲產(chǎn)生抗藥性的機(jī)制有多個方面，其中，鈉通道基因位點(diǎn)的突變是抗性分子機(jī)制之一(唐振華，2000)。昆蟲神經(jīng)細(xì)胞膜上鈉離子通道是擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)，通過控制鈉通道的失活而使昆蟲出現(xiàn)興奮狀態(tài)或中毒癥狀。昆蟲由于鈉通道基因的突變對該類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性，即擊倒抗性 (knockdown resistance,kdr) (Salgadoetal.，1983)。目前，國內(nèi)外學(xué)者對kdr進(jìn)行了深入的研究，但大多數(shù)的研究基本僅限于通道ⅡS4～ⅡS6片段(宋鋒林等，2005；Garciaetal.，2009；Kawadaetal.，2011；Xuetal.，2011；Singhetal.，2011；劉宏美等，2012；Tanetal.，2012；鄭重等，2012)，而對這一區(qū)段之外的大部分鈉通道基因研究報(bào)道的相對較少。特別是淡色庫蚊，由于其孳生環(huán)境的特殊性，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其對擬除蟲菊酯類殺蟲劑高達(dá)幾百倍甚至上千倍的抗性。如果只對鈉通道ⅡS4～ⅡS6片段進(jìn)行研究，已經(jīng)不能很好的解釋產(chǎn)生如此高倍數(shù)抗性的原因。因此，需要對鈉通道ⅡS4～ⅡS6片段外的大部分基因區(qū)段進(jìn)行全面的檢測，以期發(fā)現(xiàn)對抗性水平具有直接作用的新位點(diǎn)突變，來更好解釋高倍抗性的來源。本文的目的在于建立一種淡色庫蚊野外種群鈉通道基因全長的分子克隆方法，分析野外種群鈉通道基因的變異，為蚊蟲抗性的綜合治理提供新的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 蚊蟲的采集

本實(shí)驗(yàn)所采用的蚊蟲標(biāo)本為野外采集的河北株淡色庫蚊，采集地點(diǎn)為河北省邯鄲市成安縣(N36°26′33.41″，E114°41′4.04″)，采集時間是2012年8月。采集方法：幼蟲勺舀法，采集到幼蟲并飼養(yǎng)，羽化3～5 d后收集成雌蚊，用液氮凍存。

1.2 主要試劑

吉百特生物技術(shù)有限公司的RNA提取試劑盒(Trizol、漂洗液)；TaKaRa公司的DEPC原液和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；北京全式金生物技術(shù)有限公司的Taq 酶套餐，pEASY-T1載體，Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞和DNA Marker DL2000；TIANGEN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒，LB培養(yǎng)基，溴化乙錠(EB)，氨芐青霉素、X-gal、IPTG；INVITROGEN公司的瓊脂糖；北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司的50×TAE電泳緩沖液。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank公布的致倦庫蚊鈉通道基因序列(GenBank登錄號：AB453977.1)，在NCBI-Primer-BLAST里設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 擴(kuò)增鈉通道的六對引物序列及片段大小Tab.1 Six pairs of primers for amplifying sodium channel gene

1.4 蚊蟲基因組RNA的提取

取單只蚊蟲放入1.5 mL離心管，加入200 μL Trizol試劑，離心研磨后加入800 μL Trizol，靜置10 min。加入200 μL氯仿，震蕩后靜置5 min。15 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清到離心柱中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液(分兩次取上清)。向離心柱中加入500 μL漂洗液，12 000 r/min離心1 min，棄濾液，再空轉(zhuǎn)2 min，風(fēng)干2 min。將離心柱放入到干凈的1.5 mL離心管中，加入20μL DEPC水，靜置3 min，12 000 r/min離心1 min，濾液即為RNA提取液，保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增

逆轉(zhuǎn)錄應(yīng)體系如下：氯化鎂 2μL，10×RT 緩沖液1 μL，滅菌水3.75 μL，dNTP 混合液1 μL，RNA酶抑制劑0.25μL，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，自由引物0.5 μL。加入1 μL模板之后進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：30 ℃，10 min，45 ℃，30 min，95 ℃，5 min，5 ℃，5 min，4 ℃，保存。反應(yīng)液保存于-20 ℃?zhèn)溆谩CR 50 μL反應(yīng)體系如下：Taq酶25 μL，滅菌水 18 μL，引物各1 μL，模板5 μL。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性94 ℃,5 min；變性94 ℃，30 s，退火58/60/62/65 ℃,30 s，延伸72 ℃，1 min，循環(huán)35次；之后72 ℃，7 min，4℃保存。

1.6 PCR產(chǎn)物的回收與克隆

使用TIANGEN公司的回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、回收?；厥债a(chǎn)物與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)，菌液涂LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素、X-gal、IPTG)培養(yǎng)過夜。

1.7 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定

采用藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落加入LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)(約4 h)。鑒定選擇菌落PCR鑒定法，25 μL PCR反應(yīng)體系：Taq酶12.5 μL，無菌水 8.5 μL，M13F 0.5 μL，M13R 0.5 μL，菌液3 μL。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性94 ℃,10 min；變性94 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，1 min，循環(huán)35次；之后72 ℃，10 min，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性克隆并送生工生物工程股份有限公司測序。

1.8 序列分析

采用DNAStar軟件和CLC Genomics Workbench1.3 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接和對比分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增與重組子鑒定

圖1 kdr 基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The six target fragments of kdrM:Marker;1:引物K1；2:引物K2；3:引物K3；4:引物K4；5:引物K5;6:引物K6。M: Marker; 1: Primer K1; 2: Primer K2; 3: Primer K3; 4: Primer K4; 5: Primer K5; 6: Primer K6.

圖2 重組子的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 The identification of recombinant plasmidsM:Marker;1:空組質(zhì)粒;2～9:重組質(zhì)粒。M: Marker; 1: Vector plasmid; 2-9: Recombinant plasmids.

利用設(shè)計(jì)的6對引物，成功克隆出野外株淡色庫蚊kdr基因全長，擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示，在Marker的1 kb附近有6條特異性的條帶，條帶大小與表1設(shè)計(jì)相符(圖1)。重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果顯示，在1 kb附近有一條特異性的條帶，與設(shè)計(jì)相符(圖2)。

2.2 序列分析結(jié)果

采用DNAStar軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，與GenBank公布的鈉通道基因序列能夠吻合上，說明我們成功得到了野外種群淡色庫蚊的鈉通道基因全長，GenBank登錄號是KC977455。通過對比分析，我們發(fā)現(xiàn)了野外種群淡色庫蚊鈉通道基因上都存在多處氨基酸突變和可變剪接(圖3)。這些突變包括A32T、T336A、S342P、K535E、L1035F、N1595S和F1982L。其中，發(fā)現(xiàn)的L1035F突變與經(jīng)典的kdr突變L1014F是同一種突變，只是在不同種群中編碼位置不同。另外，發(fā)現(xiàn)鈉離子通道中存在不同形式的可變剪接。

3 討論

本研究以重要媒介蚊蟲淡色庫蚊為材料，利用RT-PCR技術(shù)，克隆出野外種群淡色庫蚊鈉通道基因全長。

通過序列對比分析，發(fā)現(xiàn)在淡色庫蚊野外種群蚊蟲的鈉通道上存在多處氨基酸突變和可變剪接。Loughney等(1989)首次從果蠅Drosophilamelanogaster中分離克隆了鈉離子通道基因，并通過實(shí)驗(yàn)證明了鈉離子通道基因的突變可能改變其功能，從而導(dǎo)致昆蟲對菊酯類農(nóng)藥產(chǎn)生抗性。昆蟲通過鈉通道基因的突變對該類殺蟲劑產(chǎn)生抗性，稱為擊倒抗性(kdr)。擊倒抗性最初是在對DDT具有抗性的意大利品系家蠅Housefly中首次被描述(Busvine，1951)。之后，在多種昆蟲中也發(fā)現(xiàn)這樣的基因突變。經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲鈉通道ⅡS6節(jié)段L1014位點(diǎn)是一個較保守的突變位點(diǎn)，經(jīng)典突變類型L1014F普遍見于各種昆蟲例如，德國小蠊German Cockroach此位點(diǎn)的突變與DDT、氯菊酯和胺菊酯抗性有關(guān)(Dong，1997)，棉蚜蟲Aphisgossypii此位點(diǎn)的突變與高效氯氟氰菊酯抗性密切相關(guān)(Marshalletal.，2012)、煙蚜Myzuspersicae此位點(diǎn)的突變可以導(dǎo)致對溴氰菊酯和DDT抗性的增加(Martinez-Torresetal.，1999)。此外，在蚊蟲中，也發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)的突變與抗性密切相關(guān)。例如，岡比亞按蚊Anophelegambiae、斯氏按蚊An.stephensi、阿拉伯按蚊An.arabiensis位點(diǎn)突變與溴氰菊酯、氯菊酯和DDT抗性有關(guān)(Yewhalawetal.，2011)。本研究也發(fā)現(xiàn)野外株淡色庫蚊中存在L1014F(L1035F)的突變。此突變的產(chǎn)生與發(fā)展也許與當(dāng)?shù)貧⑾x劑的使用密切相關(guān)。另外，在野外株淡色庫蚊鈉離子通道基因上還發(fā)現(xiàn)其他位點(diǎn)的幾個突變，例如，A32T、T336A、S342P、K535E、N1595S和F1982L。這些突變與Rinkevich(2013)總結(jié)的昆蟲鈉離子通道基因出現(xiàn)的基因突變不盡相同，其與抗性的關(guān)系也有待進(jìn)一步研究。

圖3 野外淡色庫蚊(HD)與NCBI公布的致倦庫蚊(MB)鈉通道氨基酸序列的比較Fig.3 Sequences of deduced amino acids of sodium channel from Culex pipiens pallens(HD),aligned with those Culex pipiens quinquefasciatus(NCBI number：AB453977.1).不同氨基酸用不同顏色表示,logo代表對比后氨基酸異同,-代表可變剪接,方框位置是L1014位點(diǎn)。Different colors indicate different amino acids,logo is the difference after alignment,-indicates alternative splicing and the pane location is the L1014 locus.

mRNA的可變剪接反映了遺傳信息的動態(tài)變化與遺傳信息在更高層次的重新組合，在不改變基因組DNA的前提下，使編碼序列的豐富度大大提高，是一種高效的蛋白形成方式(Blencoweetal.，2006)。He等(2012)在研究鈉通道基因的可變剪接時，發(fā)現(xiàn)了致倦庫蚊13個不同的鈉通道剪接本，并證明這些可變剪接與擬除蟲菊酯抗性有一定的關(guān)系。本研究也發(fā)現(xiàn)了多處可變剪接，這些可變剪接在豐富鈉通道蛋白多樣性方面也許會有一定的意義，但與擬除蟲菊酯的抗性關(guān)系有待進(jìn)一步研究。其中有一處是新發(fā)現(xiàn)的可變剪接，這段序列有63 bp，作為插入序列出現(xiàn)在模板序列(AB453977.1)的第5 490和5 491位堿基之間，GenBank里沒有該序列的報(bào)道。該序列中包含兩個終止密碼，具體的生理功能有待研究。

目前對蚊蟲擊倒抗性的研究，主要集中于鈉通道基因的ⅡS4～ⅡS6節(jié)段，而對該基因其他節(jié)段的認(rèn)識并不十分清楚，研究的也相對來說較少。近年來，蚊蟲抗藥性的不斷增強(qiáng)，人們也放眼于鈉通道ⅡS4～ⅡS6片段之外的大部分基因片段，以期找尋其他與抗性關(guān)系密切的新突變。對蚊蟲鈉通道點(diǎn)突變的研究對于理解蚊蟲抗藥機(jī)理有重要的意義，也為新型殺蟲劑的研究提供了理論基礎(chǔ)，為蚊蟲防治提供了新的思路。對鈉通道基因點(diǎn)突變的研究必須基于通道基因序列的獲得，本研究成功克隆出了野外種群淡色庫蚊鈉通道基因全長，并且分析了鈉離子通道上存在的變異，發(fā)現(xiàn)了與抗藥性關(guān)系密切的L1014F突變。這一方法的建立將有助于各研究學(xué)者得到需要研究的目的片段，為抗性相關(guān)突變的尋找奠定了基礎(chǔ)。