高艷彬

(陜西省康復(fù)醫(yī)院，陜西 西安 710038)

貧血屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)的“血虛”“血枯”“血證”“虛勞”“虛損”等范疇[1]。生血寶是我國(guó)著名中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用30余年。生血寶合劑由制何首烏、黃芪、女貞子、狗脊、白芍、桑葚、墨旱蓮7味藥材組方，功能養(yǎng)肝腎、益氣血，用于惡性腫瘤放射治療及化學(xué)治療所致白細(xì)胞減少及神疲乏力、腰膝酸軟、頭暈耳鳴、心悸、氣短、失眠、咽干、納差食少等癥。生血寶可促進(jìn)鐵的吸收利用、提高全血鐵的含量，適用于治療缺鐵性貧血以及放射治療、化學(xué)治療所致白細(xì)胞減少[2－4]。何首烏為蓼科植物何首烏 Polygonum multiflorum Thumb．的干燥塊根[5]，秋、冬二季葉枯萎時(shí)采挖，削去兩端，洗凈，個(gè)大的切成塊，干燥。制何首烏為何首烏的炮制加工品[6]，性味苦、甘、澀，溫，歸肝、心、腎經(jīng)，功能補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨[7]，用于血虛萎黃、眩暈耳鳴、須發(fā)早白、腰膝酸軟、肢體麻木、崩漏帶下、久瘧體虛，以及高血脂。本試驗(yàn)中，針對(duì)生血寶合劑中君藥制何首烏的主要成分二苯乙烯苷(2，3，5，4’－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷)進(jìn)行含量測(cè)定，為制訂其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters alliance高效液相色譜儀;紫外檢測(cè)器。2，3，5，4’－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷(二苯乙烯苷)對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110825－200578);乙腈(色譜純)，乙醇(分析純);生血寶合劑(清華德人西安幸福制藥有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Suntek Kromasil C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 － 水(20 ∶80)，流速:1．0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):320 nm;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)不低于2 000。

2．2 溶液制備

由于樣品為合劑，是由7味藥材加水煎煮制成，考慮其制法，故對(duì)直接定容和超聲提取時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果表明超聲提取時(shí)間與直接定容對(duì)含量影響不大(見(jiàn)表1)，考慮含量值及試驗(yàn)操作的簡(jiǎn)便性確定提取方法。精密量取樣品2 mL，加稀乙醇定容至50 mL，搖勻，上清液濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。精密稱(chēng)取二苯乙烯苷對(duì)照品5．46 mg和6．25 mg，分別置100 mL容量瓶中，加稀乙醇使溶解質(zhì)，定容，作為對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度分別為54．6和62．5 μg/mL)。取陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

表1 樣品提取方法考察結(jié)果

2．3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn):取2．2項(xiàng)下3種溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與對(duì)照品及供試品溶液色譜二苯乙烯苷相同保留時(shí)間處無(wú)相應(yīng)色譜峰，見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別精密吸取對(duì)照品溶液(54．6 μg/mL)1，2，5，10，15，20 μL，按擬訂的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 Y=3 702 020．797 8 X －10 403．714 1，R2=0．999 9(n=6)。結(jié)果表明，二苯乙烯苷進(jìn)樣量在 0．054 60～1．092 00 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別精密吸取10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液中二苯乙烯苷色譜峰峰面積的 RSD分別為0．41%和1．06%(n=6)，表明對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品(批號(hào)為110303)溶液，分別在制備 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果樣品峰面積分別為1 999 463，1 991 690，1 983 917，1 977 021，1 990 763，1 994 202，RSD=0．8%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn):對(duì)同一批樣品(批號(hào)為110303)取樣6份，依法制備供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果二苯乙烯苷平均含量為1．38 g/L，RSD=0．8%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):精密量取已知含量的同一批樣品(批號(hào)為110303)1 mL共6份，分別精密加入質(zhì)量濃度為0．254 8 g/L的對(duì)照品溶液各5 mL，按供試品溶液制備方法制備待測(cè)溶液，并按擬訂的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2．4 樣品含量測(cè)定

取10批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

取以流動(dòng)相配制的對(duì)照品溶液，以流動(dòng)相為空白，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)紫外掃描，結(jié)果二苯乙烯苷在318．4 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm[8]。

表2 二苯乙烯苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 樣品中何首烏苷含量測(cè)定結(jié)果(n=10)

采用2010年版《中國(guó)藥典(一部)》中二苯乙烯苷的流動(dòng)相為乙腈－水(25∶75)[9]進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果在5 min之內(nèi)出峰。由于出峰時(shí)間過(guò)早，故增大流動(dòng)相的極性、減小乙腈的比例，最終將流動(dòng)相定為乙腈－水(20∶80)。

生血寶合劑中制何首烏為君藥，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨[10]等功效。因此選擇何首烏中具有特征性的成分何首烏苷作為檢測(cè)指標(biāo)，同時(shí)采用具有較高專(zhuān)屬性的高效液相色譜法作為檢測(cè)方法，對(duì)該產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有很好現(xiàn)實(shí)意義。

采用高效液相色譜法測(cè)生血寶合劑中二苯乙烯苷的含量，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、干擾性小、重復(fù)性好，回收率也較高，所得結(jié)果比較準(zhǔn)確，可作為藥品標(biāo)準(zhǔn)提高的檢測(cè)方法。

[1]張登本．中醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)[M]．北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003:48．

[2]高順國(guó)，張俊偉，邱賽紅，等．生血寶顆粒對(duì)缺鐵性貧血大鼠模型鐵吸收利用影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]．上海中醫(yī)藥雜志，2005(8):56－58．

[3]羅 珊，漆蘭萍，李若平．生血寶顆粒劑治療放療、化療所致白細(xì)胞減少癥[J]．湖南中醫(yī)雜志，1994(8):23－24．

[4]吳青和．中藥藥理學(xué)[M]．北京:高等教育出版社，2007:177．

[5]康廷國(guó)．中藥鑒定學(xué)[M]．第2版．北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007:73．

[6]龔千鋒．中藥炮制學(xué)[M]．第2版．北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007:275．

[7]高雪敏．中藥學(xué)[M]．北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007:225．

[8]蔡寶昌．中藥制劑分析[M]．北京:高等教育出版社，2007:90．

[9]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M]．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:164．

[10]孫晉苓，黃曉蘭，吳惠勤，等．何首烏中順式和反式－二苯乙烯苷的HPLC/DAD/MS測(cè)定及其光穩(wěn)定性考察[J]．中國(guó)藥學(xué)雜志，2009，44(7):541－544．