阮國榮，何曉芳，黃 晶，肖石軍，陳金雄，李軍山，劉亞軒，孫耀華，陳福珍，林國忠

(1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350119;2.上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106;3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，江西 南昌 330045;4.福建省廈門國壽種豬開發(fā)有限公司，福建 廈門 350021;5.福建省光華百斯特生態(tài)農(nóng)牧有限公司，福建 尤溪 365100)

仔豬腹瀉是造成仔豬死亡的重要原因。據(jù)調(diào)查，因腹瀉死亡的仔豬占仔豬死亡總數(shù)的38.9%［1］。目前應(yīng)對仔豬腹瀉的常見辦法主要是飼料中加大抗生素劑量或使用疫苗預(yù)防，但防治效果欠佳、且會產(chǎn)生耐藥而影響后期生長、甚至導(dǎo)致抗生素殘留超標(biāo)，對食品安全造成影響。為此，改變疾病頻發(fā)的最好措施是實(shí)施抗病選育，從源頭上加以改變，培育出先天性抵抗腹瀉的種豬品種。

研究表明，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4(ETEC F4)是引發(fā)新生和斷奶前仔豬腹瀉病的最主要致病菌［2-4］。ETEC F4有3種血清型:F4ab，F(xiàn)4ac和F4ad，其最主要的血清型為F4ac［5］。ETEC F4的致病性取決于其是否能與豬小腸上皮細(xì)胞表面刷狀緣的受體特異性結(jié)合，無受體豬表現(xiàn)為抵抗型，有受體豬則表現(xiàn)為易感型。豬ETEC F4受體是由單基因控制的，呈顯隱性遺傳模式。攜帶顯性等位基因的豬對ETEC F4的侵染易感，隱性等位基因純合子豬則表現(xiàn)為抵抗型［6-7］。因此，F(xiàn)4ac受體基因的定位和鑒別是抗腹瀉育種的關(guān)鍵。在ETEC F4受體基因的精細(xì)定位和主效基因鑒別方面，瑞士Peter Vogeli小組將其精細(xì)定位于SW207-MUC4之間［8］，黃路生院士［8-12］研究組采用一系列現(xiàn)代遺傳分析手段最終鑒別到了編碼ETEC F4ac受體的目的基因-MUC13基因，發(fā)現(xiàn)了能準(zhǔn)確鑒別F4ac易感個體和抗性個體的分子標(biāo)記(準(zhǔn)確率＞97%)。而種豬性能測定及BLUP遺傳評估選育技術(shù)是近20年來國內(nèi)外豬育種界公認(rèn)的提高生產(chǎn)性能的有效方法，國內(nèi)外諸多種豬企業(yè)應(yīng)用該方法進(jìn)行種豬選育，均取得明顯效果［13-16］。為此，將仔豬抗腹瀉分子標(biāo)記育種技術(shù)結(jié)合種豬性能測定及BLUP遺傳評估選育技術(shù)開展抗腹瀉育種有望培育出生產(chǎn)性能優(yōu)異的抗腹瀉病新品系。

在國外引進(jìn)瘦肉型豬品種中，杜洛克品種的抗性有利基因頻率相對較高［17-18］，經(jīng)少數(shù)幾代選育將有可能育成抗性品系;而且在商品豬生產(chǎn)上杜洛克常被用作終端父本，具有影響面廣的特點(diǎn)。為此，本研究選取兩家具有開展性能測定的條件和經(jīng)驗(yàn)的國家級育種核心場，對其杜洛克種群開展MUC13抗性純合與性能測定的綜合選育研究，希冀培育出生產(chǎn)性能較好的抗F4ac腹瀉病豬專門化新品系。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)血緣、生產(chǎn)性能及體型外貌等表現(xiàn)，分別組建兩個杜洛克豬育種核心群，其中廈門國壽220頭(20♂、200♀)、光華百斯特55頭(5♂、50♀)，合計(jì)275頭(25♂、250♀)。組群后均同步按方案逐代進(jìn)行檢測、測定和選育。兩豬場飼養(yǎng)管理相同，營養(yǎng)水平一致。期間兩豬場間先后有6頭公豬血緣交流。

1.2 選育方案

在兩場原有選育群的基礎(chǔ)上重新確定育種核心群(25♂，250♀)。記錄育種群配種受胎及產(chǎn)仔、哺育個體情況，根據(jù)同窩及個體本身表現(xiàn)，對育種群斷奶仔豬進(jìn)行初選(剔除出現(xiàn)遺傳疾患的窩別外，其余每窩選擇 1～2♂、2～3♀)。

對入選測定(常規(guī)性能測定)的仔豬個體進(jìn)行采樣，并進(jìn)行基因檢測。根據(jù)生長發(fā)育測定結(jié)果，經(jīng)BLUP法計(jì)算個體育種值，對綜合選擇指數(shù)高、抗性基因型有利的個體進(jìn)行外貌鑒定，按指數(shù)高低，選留體型外貌符合品種特征的優(yōu)秀個體留作下一世代育種核心群;允許部分世代重疊。

實(shí)施連續(xù)3年的反復(fù)檢測、選留，比較育種群選育前后的生產(chǎn)性能指標(biāo)變化，以及育種群與未經(jīng)選育的擴(kuò)繁群仔豬腹瀉的差異。

1.3 MUC13 基因檢測

1.3.1 樣品采集與保存 按要求對育種核心群每世代選留測定的后代進(jìn)行耳樣采集，以鑒別個體MUC13基因型。

采樣部位和方法:用耳號鉗在豬耳朵上打下一小塊耳組織，放入裝有體積分?jǐn)?shù)75%酒精的樣品采集管內(nèi)，擰緊管蓋并在管壁和管蓋上用標(biāo)記筆作好耳號記錄。

樣品保存:采集好的耳組織樣品，及時(半天之內(nèi))放置在-20℃冰箱內(nèi)，以防樣品腐爛變質(zhì)。

1.3.2 DNA提取 依照標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿抽提、乙醇沉淀的方法提取，經(jīng)Nanodrop ND-1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計(jì)(熱電，美國)測定DNA濃度和質(zhì)量合格后，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 基因判別 根據(jù)江西農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的鑒別腹瀉易感/抗性個體MUC13分子標(biāo)記專利技術(shù)，委托上海生工生物有限公司合成PCR-Snapshot引物。PCR引物序列(5'-3')為Fp:GGA GAG ACC AAA CCC ACA GA，Rp:CTC CTC ACC AGC TCC TTA GC，目的片段280 bp。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括模板 DNA 40 ng、10×buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl21.2 μL、10 mmol/L dNTP 0.3 μL、Fp 0.4 μL、Rp 0.4 μL、Taq聚合酶 0.5 μL、超純水 13.2 μL。PCR 循環(huán)參數(shù):94 ℃變性 3 min，94 ℃ 30 s，退火溫度61℃ 30 s，72℃延伸45 s，共36個循環(huán)。

SNaPshot判型:采用PCR-SNaPshot判定 MUC13基因型。取1.5 μL純化后 PCR產(chǎn)物，加入2 μL SNaPshot multiplex mix(含 Taq 聚合酶和熒光標(biāo)記的 dd-NTPs)、1.2 μL 去離子水和 0.3 μL SNaPshot引物(引物序列為:TTT TTT TTT TTT TTT CCA TGT ACA TTT CAG AGT CTG AGG GAT)。混合均勻后進(jìn)行SNaPShot反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 30 s，25個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后在 SNaPshot反應(yīng)產(chǎn)物中加 0.57 μL 1 × NEB buffer和0.1 μL CIP(NEB，美國)，37 ℃ 60 min，75 ℃15 min，進(jìn)行再次純化，以清除熒光標(biāo)記的ddNTPs并滅活純化酶。最后進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測分型，方法是:每1 μL SNaPshot反應(yīng)產(chǎn)物加入8 μL上樣變性劑(由Hi-Di formamide和GeneScan 120 LIZ size standard以20∶1混合而成)95℃變性5 min;然后迅速轉(zhuǎn)置冰水浴中2 min;冷卻離心后上樣于3130XL遺傳分析儀(ABI，美國)進(jìn)行電泳檢測，最后使用GeneMapper 4.0軟件(ABI，美國)進(jìn)行判型分析。判型標(biāo)準(zhǔn)如圖1。

圖1 MUC13基因的PCR-SnaPshot檢測圖Fig.1 SNapshot genotyping patterns at the MUC13 locus

1.4 仔豬腹瀉觀察

在兩場分別選取相同胎齡的核心群與擴(kuò)繁群杜洛克母豬各10對，安排在相同欄舍，以觀察核心群與擴(kuò)繁群同期出生的仔豬腹瀉發(fā)生情況。觀察實(shí)驗(yàn)要求對同期出生(相近1周內(nèi))的仔豬記錄母豬耳號、分娩日期、同窩仔豬數(shù)量，并仔細(xì)登記有發(fā)生腹瀉的每頭仔豬耳號、腹瀉發(fā)生日齡、腹瀉延續(xù)時間、治療康復(fù)時間等，計(jì)算腹瀉比例和成活率。

1.5 生長性能測定

根據(jù)國家《種豬性能測定技術(shù)規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 822—2004)要求，剔除繁殖性能低、發(fā)生遺傳疾患等情況的整窩仔豬外，將每世代斷奶、保育選留的待測小豬(每窩選留1～2♂、2～3♀)轉(zhuǎn)入測定舍，按常規(guī)飼養(yǎng)到85～105 kg體質(zhì)量時進(jìn)行稱量、同時用ALOKA 500 B超儀進(jìn)行活體背膘測量。所有測定數(shù)據(jù)輸入GBS軟件，并校正到100 kg體質(zhì)量時日齡、活體背膘厚。

1.6 不同MUC13基因型個體的生長性能比較

根據(jù)個體的生長性能測定結(jié)果和MUC13基因型檢測結(jié)果，分析兩場3批計(jì)525頭杜洛克仔豬MUC13 3種基因型對生長性能的影響效應(yīng)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，腹瀉發(fā)生率與仔豬成活率使用Chi-square test模塊;生長發(fā)育數(shù)據(jù)使用One-Way Anova及Post Hoc模塊分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MUC13 基因檢測

由表1可見，通過3個世代的基因檢測和篩選，腹瀉抗性有利基因G頻率逐代明顯提高，而不利基因A則在核心群中逐代降低，直至完全剔除。

表1 三世代MUC13基因檢測結(jié)果Tab.1 Genotyping patterns at the MUC13 locus of the three generations pigs

2.2 仔豬腹瀉發(fā)生情況及哺乳期成活率

由表2可見，在同胎次相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，核心群與擴(kuò)繁群仔豬腹瀉發(fā)生率分別為8.7%和18.4%，兩組間仔豬腹瀉發(fā)生率差異極顯著(P=0.006)。核心群發(fā)生腹瀉的仔豬治療后較快康復(fù)，擴(kuò)繁群腹瀉仔豬在采取同樣治療措施情況下，腹瀉延續(xù)時間多需3～4 d以上，兩組的腹瀉致死率分別為12.5%和16.7%，但差異不顯著(P＞0.05);哺乳期仔豬成活率分別為94.57%和92.23%，差異也未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。

2.3 生長發(fā)育測定選育結(jié)果

通過3年來的性能測定與BLUP指數(shù)選育，生長速度和活體背膘均有一定改善，其中校正達(dá)100 kg體質(zhì)量日齡由181.34 d降低到177.48 d，但經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析，各年度間(P＞0.05)，未達(dá)顯著水平;而活體背膘由12.23 mm降低到10.77 mm，經(jīng)分析并比較，2010年與2012年間差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。

表2 育種核心群與普通擴(kuò)繁群仔豬腹瀉比例Tab.2 Diarrhea rate of piglets in the core breeding group and propagation population

表3 育種群3個世代生長性能Tab.3 Growth performance in the three generations of breeding pigs

2.4 MUC13基因型與生長性能的關(guān)聯(lián)性

從表4發(fā)現(xiàn)，易感純合基因型AA豬只達(dá)100 kg體質(zhì)量日齡較抗性純合基因型GG豬只平均增加1.56 d，背膘厚也平均增加0.36 mm;易感雜合基因型GA豬只達(dá)100 kg體質(zhì)量日齡較抗性純合基因型GG豬只平均增加1.34 d，背膘厚也平均增加0.27 mm。但經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析，均未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)，說明MUC13各基因型豬只間在生長速度和活體背膘上沒有顯著差別。

表4 不同基因型豬群生長性能Tab.4 Growth performance in different genotyping patterns of pigs

3 討論與結(jié)論

3.1 MUC13抗性基因型純合群體的選育

通過連續(xù)3個世代的MUC13基因檢測篩選以及性能測定后的BLUP指數(shù)選擇，受試育種群MUC13抗腹瀉有利基因G頻率由0.86提高到1，有利基因型GG頻率由0.75提高到1，實(shí)現(xiàn)了抗腹瀉有利基因的純合。同時，生長速度和活體背膘均有一定改善，校正達(dá)100 kg體質(zhì)量日齡由181.34 d降低到177.48 d，減少3.86 d，不過仍未達(dá)顯著水平;但活體背膘則由12.23 mm降低到10.77 mm，減少1.46 mm，且達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。經(jīng)分析，由于場內(nèi)測定受實(shí)際生產(chǎn)時間影響，豬群入測時間達(dá)6個月，且測定個體表現(xiàn)也有較大差異，雖然BLUP模型計(jì)算選擇指數(shù)時能夠校正場、年、季等造成的誤差，但進(jìn)行SPSS統(tǒng)計(jì)分析時仍有一定影響，為此，在后續(xù)的選育測定工作中，應(yīng)將核心群母豬配種安排在盡可能短時間完成，以減少因時間跨度長而造成的影響。此外，選育群體要能維持腹瀉抗性基因的純合，首先應(yīng)該堅(jiān)持在本群體內(nèi)選留后備種豬;如需要引進(jìn)血緣時，必須對引進(jìn)個體進(jìn)行MUC13基因檢測，防止導(dǎo)入易感等位基因。

3.2 MUC13抗性純合群體與哺乳仔豬腹瀉的關(guān)系

造成哺乳仔豬腹瀉的因素眾多，腸毒素大腸桿菌則是引起仔豬腹瀉的主要因素。通過MUC13基因型判定與腸毒素大腸桿菌黏附的受體有無，從而確定仔豬對大腸桿菌引起腹瀉的抗性或易感，已由江西農(nóng)大團(tuán)隊(duì)相繼研發(fā)和驗(yàn)證［9-12，19-20］，并獲得國家發(fā)明專利(專利號:200810136425)。經(jīng)普查，杜洛克群體自然選擇情況下，MUC13抗性純合程度已達(dá)70%～80%，因而，本項(xiàng)目通過對育種核心群與未經(jīng)選育的擴(kuò)繁群仔豬在相同胎次和飼養(yǎng)管理情況下的腹瀉情況觀察、統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)核心群與擴(kuò)繁群斷奶前仔豬腹瀉發(fā)生率分別為8.7%和18.4%，經(jīng)SPSS 13.0 Chi-square test分析，差異極顯著(P＜0.01);核心群與擴(kuò)繁群哺乳仔豬斷奶成活率分別為94.6%和92.3%，提高2.3個百分點(diǎn)，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，未達(dá)顯著水平。本次測試核心群和擴(kuò)繁群數(shù)量均僅20窩，所得結(jié)果雖有一定參考價值，但有待于在更大范圍進(jìn)行試驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)，以進(jìn)一步驗(yàn)證MUC13抗性純合與斷奶前仔豬腹瀉的關(guān)系。

3.3 MUC13抗性純合基因型與豬生產(chǎn)性能的關(guān)系

MUC13抗性純合基因型能減少仔豬腹瀉的發(fā)生，但抗性個體的純合對其他生產(chǎn)性能是否具有不利影響，此前尚未見報道。本研究通過對不同基因型的個體進(jìn)行生長發(fā)育性能測定，發(fā)現(xiàn)抗性純合基因型(GG)、雜合基因型(GA)及易感純合基因型(AA)個體達(dá)100 kg體質(zhì)量日齡平均分別為181.25，182.59，182.81 d，達(dá)100 kg體質(zhì)量校正背膘分別為11.50，11.77，11.86 mm，經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異均不顯著(P＞0.05)，說明MUC13基因型抗性純合選育對生長速度和背膘厚性能沒有影響。

通過3年的分子檢測與性能測定綜合選育研究，驗(yàn)證了MUC13基因抗性純合有利于降低斷奶前仔豬腹瀉的發(fā)生;生長發(fā)育性能測定及BLUP指數(shù)評估能有效降低活體背膘;而且MUC13不同基因型選擇對生長發(fā)育沒有明顯影響。

致謝:感謝江西農(nóng)業(yè)大學(xué)任軍研究員對基因檢測實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和論文修改。

［1］王明福，彭羽，肖光明.論溶菌酶防治仔豬大腸桿菌性腹瀉推廣應(yīng)用前景［J］.中國畜禽種業(yè)，2009(3):132-135.

［2］Guerin G，Duval-Iflah Y，Bonnean M，et al.Evidence for linkage between k88ab，k88ac intestinal receptors to Escherichia coli and transferring loci in pigs［J］.Anim Genet，1993，24:393-396.

［3］Moon H W，Hoffman.Prevalence of some virulence genes among Escherichia coli isolates from swine presented to a diagnostic laboratory in Iowa［J］.J Vet Diagn Invest，1999，11:557-560.

［4］陳螺眉，郭金森，黃瑜，等.福州地區(qū)哺乳仔豬腹瀉防制研究Ⅱ、致病性大腸桿菌的分離及血清型鑒定［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2002(6):8.

［5］Guinée P A M，Jansen W H.Behavior of Escherichia coli antigens K88ab，K88ac，and K88ad in immunoelectrophoresis，double diffusion，and hemagglutination［J］.Infect Immun，1979，23:700-705.

［6］Sellwood R，Gibbons R A.Adhesion of enteropathogenic Escherichia coli to pig intestinal brush borders:the existence of two pig phenotypes［J］.J Med Microbiol，1975，8:405-411.

［7］Gibbons R A，Sellwood R，Burrows，et al.Inheritance of resistance to neonatal E.coli iarrhea in the pig:examination of the genetic system［J］.Theor Appl Genet，1977，51:65-70.

［8］Joller D，J?rgensen C B，Bertschinger H U，et al.Refined localization of the Escherichia coli F4ab/F4ac receptor locus on pig chromosome 13［J］.Anim Genet，2009，40:749-752.

［9］Peng Q L，Ren J，Yan X M，et al.The g.243A＞G mutation in intron 17 of MUC4 is significantly associated with susceptibility/resistance to ETEC F4ab/ac infections in pigs［J］.Anim Genet，2007，38:397-400.

［10］Wang Y，Ren J，Lan L，et al.Characterization of polymorphisms of ransferring receptor and their association with susceptibility to ETEC F4ab/ac in pigs［J］.J Anim Breed Genet，2007，124:225-229.

［11］Zhang B，Ren J，Yan X，et al.Investigation of the porcine MUC13 gene:isolation，expression，polymorphisms and strong association with susceptibility to enterotoxigenic Escherichia coli F4ab/ac［J］，Animal Genetics，2008，39:258-266.

［12］Ren J，Tang H，Yan X M，et al.A pig-human comparative RH map comprising 20 genes on pig chromosome 13q41 that harbours the ETEC F4ac receptor locus［J］.Journal of Animal Breeding and Genetics，2009，126:30-36.

［13］劉敬順，劉小紅.全自動種豬性能測定系統(tǒng)(F.I.R.E)在豬育種中的研究和應(yīng)用［J］.今日養(yǎng)豬業(yè)，2004(3):72-74.

［14］肖煒.豬育種新技術(shù)及其應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.豬業(yè)科學(xué)，2006，10:12-15.

［15］Rothschild M F.Genetic and genomic technologies from A-Z，Pig Genetics Workshop［G］.2010:25-38.

［16］孫德林，云鵬.2011年中國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展研究報告［R］.中國種豬信息網(wǎng)，2012-09-26.

［17］阮國榮，肖石軍，徐盼，等.福建省商業(yè)豬種MUC13、IGF2、和RYR1基因主效位點(diǎn)的遺傳變異分析［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，34(5):997-1002.

［18］Ruan G R，Xing Y Y，F(xiàn)an Y，et al.Genetic variation at RYR1，IGF2，F(xiàn)UT1，MUC13，and KPL2 mutations affecting production traits in Chinese commercial pig breeds［J］，Czech J Anim Sci，2013，58(2):65-70.

［19］晏學(xué)明.豬腸毒素大腸桿菌F4流行病學(xué)調(diào)查及其受體的遺傳學(xué)研究［D］.南昌:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［20］Ren J，Yan X，Ai H，et al.Susceptibility towards enterotoxigenic Escherichia coli F4ac diarrhea is governed by the MUC13 gene in pigs［J］.PLoS One，2012，7:e44573.