楊鵬飛，熊建華，2* ，杜華英，2，羅秋水，2，吳國(guó)平，2

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045;2.南昌市農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330045)

金銀花(Lonicera japonica Thunb)為忍冬科植物，具有清熱解毒［1－2］、抗菌消炎［3－4］、保肝利膽［5－6］等功能，是藥食兩用的大宗中藥材，其葉片因產(chǎn)量較高，綠原酸、黃酮等多酚類物質(zhì)含量豐富［7－8］，抑菌［9－10］、抗氧化［11］等藥理活性較好，在許多中藥、中成藥及飲料中廣泛使用，然而，金銀花葉不僅化學(xué)成分復(fù)雜［12－13］，綠原酸在干葉中含量可達(dá) 5.69%，3，4－二咖啡?？鼘幩?異綠原酸 B)，3，5－二咖啡?？鼘幩?異綠原酸A)等同系物在葉中也有一定含量，木犀草苷含量達(dá)干葉的3.48%，另外，還含有裂環(huán)氧化馬錢素、β－谷甾醇，胡蘿卜苷等，并且隨著采收期的不同存在差異。中藥材的品質(zhì)鑒定一直是人們關(guān)注的重點(diǎn)，人們常限制于采用一種或幾種成分作為藥材品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，然而中藥材為多組分復(fù)雜體系，單一地測(cè)定一個(gè)或幾個(gè)成分不能全面地反映中藥材的內(nèi)在質(zhì)量，指紋圖譜技術(shù)［14－18］能提供豐富鑒別信息，較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)，已被WHO、FDA和其他權(quán)威機(jī)構(gòu)采納作為中草藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。因此，為了更全面評(píng)價(jià)金銀花葉藥材質(zhì)量和控制質(zhì)量的穩(wěn)定性，本文對(duì)一年逐月采收共12批金銀花葉藥材進(jìn)行了高效液相指紋圖譜研究，并采用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦使用的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2004A)”對(duì)不同采收期金銀花葉藥材的指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，以期為更全面評(píng)價(jià)金銀花葉一年品質(zhì)變化規(guī)律、確定金銀花葉最佳采收期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原材料:金銀花葉，采自江西南昌，共12批，經(jīng)江西中醫(yī)學(xué)院鄒嘉玉老師鑒定，具體見表4。

主要儀器:Waters 1525型高效液相色譜儀(配Waters 2487型紫外雙波長(zhǎng)檢測(cè)器，Breeze色譜工作站)，美國(guó) Waters 公司;Alltech Alltima C18 柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)，美國(guó) GRACE 公司;TGL－16G高速冷凍離心機(jī)，上海精密儀器有限公司;FA1104N型電子天平，上海精密儀器有限公司;KQ3200DA型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

主要試劑:綠原酸對(duì)照品(批號(hào):110753－200413)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，乙腈、甲醇為色譜純，乙醇、磷酸等為分析純，超純水自制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Alltech Alltima C18(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)－0.4%磷酸水溶液(B)，分別抽濾(濾膜為 0.45 μm)、超聲脫氣。按表 1梯度洗脫，流速:0.7 mL/min;柱溫:40 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):238 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Procedure of linear gradient elution

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別準(zhǔn)確稱取一定量的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品置50 mL小燒杯中，加入50%甲醇溶解，洗入50 mL容量瓶定容，各配制濃度為20、30、40、50、60 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻。以上標(biāo)準(zhǔn)液均用封口膠封口置于4℃冰箱中、避光存放。

1.2.3 供試品溶液的制備 分別定量稱取0.5 g預(yù)處理后的樣品于100 mL錐形瓶(已編號(hào))中，加入50%甲醇50 mL稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，冷卻然后再稱定質(zhì)量，補(bǔ)足損失，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液，微孔濾膜過濾，即得。

1.2.4 指紋圖譜建立的方法學(xué)考察 為了考察檢測(cè)方法的可靠性，采用相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積標(biāo)定共有指紋峰。以圖譜中綠原酸色譜峰(2號(hào)峰)的保留時(shí)間為1和峰面積為100。計(jì)算其它各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。取同一樣本平行制備2份，在其中一份樣品中加一定量的綠原酸(2號(hào)峰)平行測(cè)定3次，計(jì)算出樣品的含量及方法的回收率。取同一份樣本制備液，連續(xù)進(jìn)樣6次，做精密度試驗(yàn)。取同一樣本，分別在制備后0 h、5 h、10 h、15 h、1 d、5 d進(jìn)樣(冰箱中冷藏)，做穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一樣本平行制備6份，分別進(jìn)樣分析，做重復(fù)性試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜建立的色譜條件分析

金銀花葉所含成分較豐富，選用250 mm C18反向柱。試驗(yàn)比較了Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)、Alltech Alltima C18 柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)、Venusil XBP C18(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)3種色譜柱，在相同的色譜條件下，色譜峰峰形、分離度、保留時(shí)間等均以 Alltech Alltima C18 柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)為最佳。

比較甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0.4%磷酸、乙腈－0.4%磷酸等多種流動(dòng)相分離金銀花葉供試品溶液中性質(zhì)差異較大的各個(gè)組分，結(jié)果表明乙腈色譜系統(tǒng)較甲醇系統(tǒng)好，系統(tǒng)信息量相對(duì)較多，能較全面地反映金銀花葉的化學(xué)成分，而且金銀花葉中含較多的酚酸類物質(zhì)，含磷酸的流動(dòng)相可較好解決拖尾現(xiàn)象，峰形較好，因此，乙腈－0.4%磷酸溶液系統(tǒng)為較好的流動(dòng)相。

比較檢測(cè)波長(zhǎng)238、325、254、280、300、360 nm金銀花葉活性物質(zhì)色譜圖。檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm所獲色譜圖的峰較多，包括了所有其他波長(zhǎng)檢測(cè)到的色譜峰，而且有較強(qiáng)吸收，故選擇238 nm作為指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)。柱溫也是檢測(cè)關(guān)鍵因素，經(jīng)過試驗(yàn)金銀花葉指紋圖譜檢測(cè)柱溫選擇40℃。

2.2 指紋圖譜建立的樣本提取條件分析

不同提取方法會(huì)影響金銀花葉活性物質(zhì)的提取效果(圖1)。對(duì)比超聲提取和回流提取，超聲提取金銀花葉的效果比回流提取好，并且超聲提取比較簡(jiǎn)便，提取時(shí)間較短，所以選用超聲提取金銀花葉活性物質(zhì)。

圖1 不同提取方法色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of different extraction methods

提取時(shí)間不同會(huì)影響金銀花葉活性物質(zhì)的提取效果(圖2)。金銀花葉成分的浸提量隨著超聲時(shí)間而逐漸增多，超聲提取30 min的金銀花葉成分含量高于提取10 min、20 min提取量，30 min之后提取的量較30 min的量相差不是很明顯，故選用超聲提取30 min。

不同提取溶劑對(duì)金銀花葉活性物質(zhì)的提取效果影響較大(圖3)，不僅使其活性成分有所差異，還會(huì)影響其活性物質(zhì)的含量。金銀花葉可用水、不同濃度的甲醇或乙醇進(jìn)行提取，乙醇對(duì)HPLC有溶劑干擾;水的極性較大，能提取極性較大的成分且提取的組分較為單一、提取液過濾困難;不同濃度的甲醇較適宜做提取測(cè)定。其中50%甲醇提取效果最好，提取成分較多，峰形好且整體分離效果較好，因此選用50%甲醇提取金銀花葉活性物質(zhì)。

圖2 不同超聲時(shí)間提取色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of different ultrasonic extraction time

圖3 不同溶劑提取的色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of different extraction solvents

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 回收率 取同一樣本按1.2.3項(xiàng)方法平行制備溶液2份，在其中一份樣品中加一定量的綠原酸(2號(hào)峰)平行測(cè)定3次，計(jì)算出樣品的含量及方法的回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The results of recovery rate test

由表2可知，樣品加標(biāo)的平均回收率達(dá)99.46%，RSD為1.83%，方法的準(zhǔn)確性高。

2.3.2 儀器精密度 取同一供試品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)測(cè)定6次，以“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(版本2004A)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，輸出9個(gè)共有峰保留時(shí)間的RSD 0.17%～0.29%，峰面積RSD為 0.52%～2.7%，儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，按上述色譜條件，于0 h、5 h、10 h、15 h、1 d、5 d測(cè)定，以“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(版本2004A)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，輸出9個(gè)共有峰保留時(shí)間的RSD 0.21%～0.28%，峰面積RSD為0.65%～2.8%，結(jié)果表明，樣品測(cè)試液放在冰箱中冷藏，組分的性質(zhì)穩(wěn)定，5 d內(nèi)未見明顯變化。

2.3.4 重現(xiàn)性考察 準(zhǔn)確稱取同一供試樣品6份，按1.2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，以“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(版本2004A)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，輸出9個(gè)共有峰保留時(shí)間的RSD 0.31%～0.38%，峰面積 RSD 為 0.61%～2.7%，6 個(gè)樣品色譜圖相似度經(jīng)分析大于 0.97，證明提取工藝及分析方法的重現(xiàn)性良好。

表3 12批金銀花葉的9個(gè)特征峰的相對(duì)保留值a和相對(duì)峰面積值RATab.3 Relative retention time(a)and areas(RA)of common peaks for fingerprint of twelve batches Lonicera japonica leaves

2.4 指紋圖譜的建立

在同一個(gè)色譜條件下，對(duì)收集的12批金銀花葉進(jìn)行測(cè)定，比較樣品的HPLC指紋圖譜，得9個(gè)共有特征峰，并且它們峰面積之和占總峰面積的90%以上，因此確定這9個(gè)峰為共有指紋峰。本試驗(yàn)中綠原酸的出峰時(shí)間居中(出峰時(shí)間21.72 min，2號(hào)峰)各樣品中均具有較高含量，且為金銀花產(chǎn)品的主要功能成分，選擇綠原酸為內(nèi)參照峰，按照文獻(xiàn)［19］的計(jì)算方法得出各樣品的特征峰的相對(duì)保留時(shí)間值a。12批樣品以7號(hào)金銀花葉的特征峰面積總和最大，再以7號(hào)金銀花作對(duì)照，按照文獻(xiàn)［20］的計(jì)算方法得出各樣品的特征峰的相對(duì)峰面積值RA。結(jié)果見表3，指紋圖譜見圖4。

通過RA值的比較，可以清楚地知道各樣品中具有相同a值組分的相對(duì)含量為多少。從表3可以看出，7號(hào)樣品的∑RA值明顯比其它樣品高，它綠原酸的RA值也最高，屬于質(zhì)地最好的藥材。特征峰的a值偏差較小，可見該指紋圖譜法重現(xiàn)性好，通過相對(duì)峰面積的比較就可以大致識(shí)別金銀花葉的質(zhì)量，結(jié)果準(zhǔn)確。

圖4 不同月份采收金銀花葉HPLC指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprint of Lonicera japonica leaves in diferent collecting time

圖5 不同采收月份對(duì)照色譜圖Fig.5 The reference chromatogram of Lonicera japonica leaves in diferent collecting time

將12個(gè)不同月份采收金銀花葉樣品圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度計(jì)算軟件(版本2004A)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用自動(dòng)匹配方法進(jìn)行相似性分析。用中位數(shù)法生成對(duì)照譜圖(圖5)，時(shí)間窗寬度為0.5 min，與對(duì)照譜圖比較，計(jì)算12個(gè)不同月份樣品的相似度系數(shù)。結(jié)果見表4。

表4 不同月份采收金銀花葉藥材相似度結(jié)果Tab.4 HPLC chromatogram similarity of Lonicera japonica leaves in diferent collecting time

從色譜圖及表4上可以看出，1、2、3、4、8、9、10、11、12月份采收的金銀花葉與對(duì)照譜圖相似度較高，在 0.93 以上，而 5、6、7 與對(duì)照譜圖相似度稍低，分別為 0.884、0.870、0.859。

2.5 金銀花葉最佳采收期的選擇

將峰面積最大的2號(hào)峰(綠原酸)峰面積及總峰面積與采收月份做柱形圖(圖6)，從圖6可以看出，綠原酸在1、2、3、4月含量均較高，5月份較低，6月份有上升趨勢(shì)，7月份達(dá)到最高，8月份之后開始下降，至12月份最低，可能的原因是金銀花植物在春天時(shí)大量生長(zhǎng)，產(chǎn)生較多的酚性物質(zhì)，而5月份開花，多酚類物質(zhì)會(huì)從葉片中向花中運(yùn)輸，從而產(chǎn)生低點(diǎn)，這與李楊昕等［21］研究發(fā)現(xiàn)葡萄植株的酚類物質(zhì)在結(jié)果期間會(huì)大量向果實(shí)運(yùn)輸產(chǎn)生低點(diǎn)相一致，之后的6、7月，天氣晴好，光合作用旺盛，又產(chǎn)生大量的酚性物質(zhì)，Ning等［22］利用采后的金銀花進(jìn)行試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)紫外照射能促進(jìn)產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)。而總峰面積積累的規(guī)律則是從1月份一路上升，到7月份達(dá)最高峰，8月份之后開始下降。在7月綠原酸含量最高時(shí)，總峰面積也最大，并且此時(shí)花已收獲，植株需修枝剪葉，因而，金銀花葉片最佳的采收期為7月。

圖6 不同月份采收金銀花葉綠原酸、總峰峰面積圖Fig.6 Area of chlorogenic acid peak and the total peak of different collecting time Lonicera japonica leaves HPLC chromatogram

3 討論與結(jié)論

單一地測(cè)定一個(gè)或幾個(gè)成分不能全面地反映中藥材的內(nèi)在質(zhì)量，不能滿足對(duì)中藥材深入研究的需要，指紋圖譜技術(shù)是指采用現(xiàn)代分析手段測(cè)定得到的能夠標(biāo)示樣品中共有特性的圖譜，從多組分的角度反映原材料的內(nèi)在特征［23－24］，并且方法回收率高、重現(xiàn)性、精密性、穩(wěn)定性均較好，具有一定科學(xué)性。

研究［25］顯示，植物在不同生長(zhǎng)期內(nèi)成分會(huì)產(chǎn)生較大差異影響品質(zhì)，目前關(guān)于金銀花葉不同生長(zhǎng)期質(zhì)量變化規(guī)律、品質(zhì)鑒別和最佳采收期的研究工作較少，本文通過對(duì)一年中逐月采收得到的12批樣本的HPLC指紋圖譜進(jìn)行研究，不同月份金銀花葉指紋峰之間即有相關(guān)性，又有差異，主要體現(xiàn)在化學(xué)成分上較為相似，但相對(duì)峰面積并不相同，說(shuō)明各樣品內(nèi)在質(zhì)量有差別，12份樣品相似性來(lái)看，1、2、3、4、8、9、10、11、12月份采收的金銀花葉與對(duì)照譜圖相似度較高，在 0.93以上，而 5、6、7月與對(duì)照譜圖相似度稍低，分別為 0.884、0.870、0.859，說(shuō)明在 5、6、7月的藥材成分變化較大，同時(shí)比較 2 號(hào)峰(綠原酸)峰面積及總峰面積，均以7月份最大，并且此時(shí)花已收獲，植株需修枝剪葉，因此，金銀花葉最佳采收期為7月。

金銀花葉有效成分中含有較多的酚性物質(zhì)，與50%甲醇極性相似，采用50%甲醇作為溶劑，超聲提取，超聲波產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)和空化作用，提取效果較好，但超聲波同時(shí)產(chǎn)生熱效應(yīng)，時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)對(duì)酚性物質(zhì)具有破壞作用，因而，提取時(shí)間不能過長(zhǎng)，30 min為宜。

金銀花葉成分豐富，體系復(fù)雜，并含有較多酸性酚類成分，高效液相檢測(cè)時(shí)選用Alltech Alltima C18色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)梯度洗脫，流動(dòng)相以乙腈－水體系為好，流速較慢為 0.7 mL/min，加入磷酸有助于解決酸性成分的拖尾現(xiàn)象，溫度40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm。

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