王筱嘯，王軍祥，趙 越，李迎坤，陳 剛

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院器官移植研究所，湖北 武漢 430032)

在移植前或移植后早期，使用針對T淋巴細胞的多克隆抗體誘導(dǎo)治療可以成功減少急性排斥發(fā)生率及與移植相關(guān)的患者死亡率［1］。依據(jù)免疫原和免疫動物物種的不同，可分為不同的多克隆抗體?？剐叵偌毎庖咔虻鞍?anti thymocyte immunoglobulins，ATGs)是由人的胸腺細胞免疫馬或者兔而得到的多克隆抗體。臨床使用中發(fā)現(xiàn)兔抗來源的ATGs效果更好。目前，抗人胸腺細胞免疫球蛋白(anti-human thymocyte immunoglobulin，ATG)是臨床廣泛應(yīng)用的兔抗人ATGs，用于免疫誘導(dǎo)和急性排斥反應(yīng)的治療。近來德國費森尤斯公司生產(chǎn)的抗人T淋巴細胞免疫球蛋白(anti-human T-lymphocyte immunoglobulins，ALG)也已在國內(nèi)上市。ALG是以人白血病T細胞株Jurkat細胞系的T淋巴細胞作為免疫抗原進行制備的兔抗人T細胞免疫球蛋白。ATG和ALG制備過程及藥物劑量均不同，ATG為5 mg/ml×5 ml/瓶，ALG 為 20 mg/ml×5 ml/瓶。殺傷淋巴細胞的效價也未見報道。二者臨床應(yīng)用的劑量仍存在爭論。本文通過對正常受試者外周血淋巴細胞體外淋巴毒試驗和流式細胞術(shù)比較兩種ATGs殺傷淋巴細胞的效價，以期對臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 ATG:兔抗人胸腺細胞免疫球蛋白，5 mg/ml×5 ml/瓶，法國賽達藥廠。ALG:兔抗人T淋巴細胞免疫球蛋白，20 mg/ml×5 ml/瓶，德國費森尤斯公司。淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物科技制品有限公司。

1.2 主要實驗儀器 超凈工作臺(蘇州安泰公司);倒置顯微鏡(Olympus公司);恒溫水浴箱(北京長風(fēng)醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠);臺式高速離心機(德國EPPENDORF公司);流式細胞儀(BD公司，F(xiàn)ACSCalibur)。

1.3 方法 ①人外周血淋巴細胞分離:健康志愿者6名(男5名，女1名，年齡25～28歲)，抗凝管分別采集6人外周血各10 ml。密度梯度離心法收集淋巴細胞并調(diào)整濃度至0.6×106/ml備用。②體外淋巴細胞毒試驗(CDC):ALG原液1∶4稀釋至與ATG相同濃度(5 mg/ml)，將相同濃度的ATG與ALG倍比稀釋為1∶1至1∶512。取各滴度ATG和ALG每管50 μl加入250 μl淋巴細胞混勻，4℃孵育50 min。每管加入兔補體50 μl混勻，37℃孵育30 min。每管加入7 μl PI避光孵育15 min。流式細胞儀檢測淋巴細胞死亡率。以上各步驟間均需流式緩沖液洗1次，1500 rpm×5 min。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATG和ALG對人外周血淋巴細胞的殺傷作用 圖1a顯示滴度為1∶16時淋巴細胞殺傷，R1區(qū)域為淋巴細胞圈門，可見門內(nèi)細胞明顯分為左右兩群，左群為被ATG殺傷淋巴細胞，右群為存活淋巴細胞。圖1b為圖1a的直方圖顯示，可見左右兩個峰，左側(cè)為存活淋巴細胞，M1為PI染色的死亡淋巴細胞，可見此滴度下淋巴細胞殺傷比率為51.39%。圖1c根據(jù)不同滴度殺傷淋巴細胞比率做成折線圖，可見殺傷淋巴細胞比率隨著稀釋滴度增加而減低。但在絕大多數(shù)滴度ATG殺傷均高于ALG，其余殺傷曲線也有相同的趨勢。體外淋巴毒試驗中ATG對6名健康志愿者外周血淋巴細胞具有明顯殺傷作用。圖1c、圖2a顯示滴度為1:1時殺傷淋巴細胞比率最高為54.06% ～82.49%［(66.24±10.35)%］。隨著稀釋滴度的增加，殺傷比率逐漸下降，在 1∶128時殺傷比率＜10%［(5.59±2.59)%］，可以認為此滴度下ATG對淋巴細胞已無明顯殺傷作用。

2.2 ALG對人外周血淋巴細胞的殺傷作用 體外淋巴毒試驗中ALG對外周血淋巴細胞也具有較強的殺傷作用。圖1c、圖2a顯示與ATG相似，滴度為1∶1時殺傷效果最強為38.06% ～70.38%［(59.8±11.8)%］。隨著稀釋滴度的增加，殺傷效果逐漸下降，在 1∶64時殺傷比率＜10%［(6.31±4.80)%］。

2.3 ATG和ALG殺傷淋巴細胞效價的比較 圖2a顯示，以淋巴細胞細胞殺傷比率10%為轉(zhuǎn)陰點，可見ATG殺傷淋巴細胞平均轉(zhuǎn)陰滴度為1∶128，ALG轉(zhuǎn)陰滴度為1∶64。ATG和ALG對于相同滴度下各組淋巴細胞殺傷差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)。為更直觀的比較兩者，將圖2a中的ALG曲線依次后移，即ALG 1∶1對應(yīng)ATG 1∶2，依次類推得到圖2b。兩條曲線趨勢一致，幾乎貼合。此時ATG和ALG對于相同滴度下各組淋巴細胞殺傷差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.93)，可以認為各滴度ATGF與低于其濃度一倍的ATG殺傷淋巴細胞的效價相同。即相同濃度下ATG殺傷效價大約是ALG的2倍。

圖1 a:散點圖展示淋巴細胞殺傷;b:直方圖顯示淋巴細胞殺傷;c:根據(jù)不同滴度殺傷淋巴細胞比較率成折線圖

圖2 ATG和ALG對6名志愿者淋巴細胞殺傷的比較

2.4 ATG和ALG殺傷T、B淋巴細胞的比較 分別用FITC和APC標(biāo)記T/B淋巴細胞，研究兩種ATGs對淋巴細胞亞群的殺傷。圖3顯示滴度1∶16時ATG和ALG殺傷CD19+B和CD3+T淋巴細胞的比例。此滴度下ATG殺傷B淋巴細胞百分比為48.6%，明顯高于ALG的37.2%。ATG殺傷T淋巴細胞百分比為64.7%，亦高于ALG的55.4%。綜合所有志愿者殺傷淋巴細胞亞群的比例ATG和ALG對外周血T淋巴細胞殺傷差異無統(tǒng)計學(xué)意義［(51.23±14.03%)vs(49.84±5.82)%，P=0.81］，兩者對B淋巴細胞殺傷差異有統(tǒng)計學(xué)意義［(40.45±13.02)%vs(24.31±9.67)%，P=0.03］?？梢哉J為ATG和ALG殺傷T淋巴細胞效果相同，但ATG殺傷B淋巴細胞強于ALG。

3 討論

抗淋巴細胞制劑自1960年起便應(yīng)用于腎移植［2］。ATG和ALG是目前臨床應(yīng)用較為廣泛兩種抗淋巴細胞免疫球蛋白。二者均是兔抗人制劑，但制備過程略有不同。ATG是以人的胸腺細胞作免疫抗原注入新西蘭兔體內(nèi)，進行純化和消毒后得到的多克隆抗體。ALG則是以人工培養(yǎng)分離的人白血病T細胞株Jurkat細胞系的T淋巴細胞作為免疫抗原進行制備［4，5］。為了比較 ATG和ALG殺傷淋巴細胞的效價，我們在體外淋巴毒試驗中，將ATG和ALG分別進行倍比稀釋。并將兩者殺傷同一患者同一滴度下的淋巴細胞數(shù)據(jù)進行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)。說明相同滴度下兩種ATGs殺傷淋巴細胞的效價并不相同。而將1∶1稀釋的ATG-F與1∶2稀釋的ATG進行配對(以此類推至1∶512稀釋的ATG-F與1∶256的ATG配對)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.933)，說明ATG-F與低于其濃度一倍的ATG殺傷淋巴細胞的效價相同。再結(jié)合多個單獨的個例，ATG轉(zhuǎn)陰均較ATG-F延遲一個滴度。ALG平均在滴度1∶64轉(zhuǎn)陰，而ATG是1∶128。我們推斷ATG殺傷淋巴細胞效價大約是ALG的兩倍。進行淋巴細胞分群，ATG對T/B淋巴細胞均有顯著殺傷作用。ALG對T淋巴細胞殺傷明顯，但對B淋巴細胞殺傷弱于ATG。不同的制備過程作為一種潛在的因素決定了兩種ATG對特異性淋巴細胞抗原的不同免疫抑制活性。此外我們還發(fā)現(xiàn)體外淋巴毒試驗中，ATG和ALG殺傷淋巴細胞存在明顯的個體差異。在6名志愿者中，ATG殺傷淋巴細胞比率最大可達82.49%，最小為54.06%。ALG最大為70.38%，最小為38.06%。

圖3 滴度為1∶16的ATG和ALG殺傷同一志愿者CD19+B和CD3+T淋巴細胞比例

綜上所述，本實驗證明ATG和ALG均可顯著清除正常人外周血淋巴細胞，但個體差異較大。相同濃度下，ATG的效價大約是ALG的2倍。此外，ATG比ALG有更強的清除B細胞的作用。這些結(jié)果將對臨床選擇ATGs的種類和適宜的劑量提供依據(jù)。

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