孟慶海，殷秋憶，郭 靜，卞慧敏

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210046)

桑葉是?？浦参锷涞母稍锶~，在全國大部分的地區(qū)均有生長。桑葉具有降血糖、降血壓、降血脂、抗炎等作用，由于其含有黃酮類、生物堿類、植物甾醇、γ-氨基丁酸及桑葉多糖等多種物質(zhì)，因此桑葉具有廣泛的生物活性和臨床應(yīng)用［1-3］。桑葉的藥用作用很明確，1993年衛(wèi)生部即確定了桑葉既是食品又是藥品。從古至今，桑葉作為治療消渴癥 (即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的糖尿病)的中藥應(yīng)用于中醫(yī)臨床［4］。但由于桑葉的采收期、產(chǎn)地等的不同，其品質(zhì)差異很大［5］，臨床療效也會產(chǎn)生巨大的差異。因此本實驗對桑葉中的主要成分進(jìn)行了降血糖作用的篩選，并將篩選的有效部位進(jìn)行配比，以期望為臨床應(yīng)用提供質(zhì)量可控、療效確切的新制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物和試劑 格列苯脲片 (天津太平洋制藥有限公司);阿卡波糖 (杭州中美華東制藥有限公司);二甲雙胍(北京中惠藥業(yè)有限公司);4種桑葉提取物，即桑葉多糖、桑葉生物堿、桑葉總黃酮、桑葉提取物 (鎮(zhèn)江吉貝爾藥業(yè)有限公司);四氧嘧啶 (SIGMA公司);淀粉 (南京化學(xué)試劑有限公司);葡萄糖 (南京化學(xué)試劑有限公司);氯化鈉(南京化學(xué)試劑有限公司);葡萄糖測定測試盒 (南京建成生物研究所)。

1.1.2 動物 ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雄性，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2012-0002。使用許可證號:SYXK(蘇)2012-0042。

1.1.3 儀器 低速自動平衡離心機 (北京醫(yī)用離心機廠);BioTek酶標(biāo)儀 (美國BioTek公司)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的制備 ICR種小鼠禁食不禁水12 h后，尾靜脈注射四氧嘧啶85 mg/kg(四氧嘧啶溶于0.9%氯化鈉中，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光冰浴保存)，正常對照組尾靜脈注射相同容積生理鹽水。60 h后，禁食12 h，眼眶取血，37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min，3000 r/min離心，分離血清測血糖，取血糖值11 mmol/L以上的小鼠為糖尿病模型動物。

1.2.2 糖尿病小鼠降血糖試驗 有效部位的篩選:將造模成功的小鼠按血糖值隨機分為模型組、桑葉多糖組、桑葉生物堿組、桑葉總黃酮組、桑葉提取物組及陽性藥格列本脲1.95 mg/kg組，灌胃給藥，篩選藥物給藥劑量按生藥量計算為20 g/kg，模型組灌胃等容積的水，每日1次，連續(xù)10 d。在確認(rèn)有效部位后，采用均勻設(shè)計 (見表1)進(jìn)行有效部位最佳配比的確定。最后用最佳配比進(jìn)行驗證:將造模成功的小鼠按血糖值隨機分為模型組，桑葉生物堿+桑葉總黃酮低劑量 (90+15)mg/kg組、中劑量 (180+30)mg/kg組、高劑量 (360+60)mg/kg組，陽性藥物阿卡波糖39 mg/kg組，灌胃給藥，模型組灌胃等容積的水，每日1次，連續(xù)10 d。測定給藥5 d后、10 d后血糖。

因素1總黃酮7個水平的質(zhì)量濃度為按照2因素7水平均勻設(shè)計表配制藥物見表2中1～7，8僅含有總黃酮，9僅含有總生物堿。每組按表中的質(zhì)量濃度取樣，各配制50 mL(用蒸餾水配置)。

表1 2因素7水平均勻設(shè)計

表2 各組給藥劑量配比

將造模成功的小鼠按血糖值隨機分為編號1組 (12只)、2組 (11只)、3組 (12只)、4組 (10只)、5組(11只)、6組 (11只)、7組 (10只)、8組 (10只)、9組 (10只)及模型組 (10只)，總黃酮得率為1.2%(12 mg總黃酮相當(dāng)于1 g生藥)，總生物堿得率為0.2%(2 mg總生物堿相當(dāng)于1 g生藥)，按表2配制藥物后小鼠按10 mL/kg體質(zhì)量灌胃給藥。因素1總黃酮給藥劑量的7個水平為 (1)200 mg/kg， (2)300 mg/kg， (3)400 mg/kg，(4)500 mg/kg， (5)600 mg/kg， (6)700 mg/kg， (7)800 mg/kg。因素2總生物堿給藥劑量的7個水平為 (1)25 mg/kg， (2)50 mg/kg， (3)75 mg/kg， (4)100 mg/kg，(5)125 mg/kg，(6)150 mg/kg，(7)175 mg/kg。模型組灌胃等容積的水，每日1次，連續(xù)10 d。

1.2.3 正常小鼠糖耐量試驗

1.2.3.1 多糖糖耐量 取正常小鼠50只按血糖值隨機分為5組，空白對照組，阿卡波糖39 mg/kg組，桑葉總黃酮+桑葉總生物堿 (90+15)mg/kg、(180+30)mg/kg、(360+60)mg/kg 3個劑量組，小鼠禁食12 h后單次灌胃給藥，空白組給予等體積的水，給藥1 h后，眼眶取血測定0 h時血糖。之后各組均給予10%淀粉溶液3 g/kg，灌胃淀粉后30、60、120 min眼眶取血測各組動物的血糖。

1.2.3.2 單糖糖耐量 取正常小鼠50只按血糖值隨機分為5組，空白對照組，二甲雙胍130 mg/kg組，桑葉總黃酮+桑葉總生物堿 (90+15)mg/kg、(180+30)mg/kg、(360+60)mg/kg 3個劑量組，小鼠禁食12 h后單次灌胃給藥，空白組給予等體積的水，給藥1 h后，眼眶取血測定0 h時血糖。之后各組均給予葡糖糖溶液3 g/kg，灌胃葡萄糖溶液30、60、120 min后眼眶取血測各組動物的血糖。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù) 以SPSS 19.0軟件統(tǒng)計，采用單因素方差分析，結(jié)果以表示，兩組數(shù)據(jù)間的顯著性采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計，P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同桑葉提取物對糖尿病小鼠血糖的影響 與模型組比較，各給藥組在給藥第5天后血糖值均有下降，格列苯脲組、桑葉生物堿組、桑葉總黃酮組與模型組比較差異有顯著性 (P＜0.05，P＜0.01)，且桑葉生物堿和總黃酮降血糖作用優(yōu)于多糖和其他。桑葉生物堿組、桑葉總黃酮組給藥第10天仍可見降低血糖作用，與模型組比較差異亦有顯著性 (P＜0.05，P＜0.01)。在給藥第10天桑葉其他組也可見血糖下降，與模型組比較差異也有顯著性 (P＜0.05)。桑葉多糖組血糖有降低的趨勢，但與模型組比較無顯著性差異?？傊Ｈ~不同成分的降血糖作用，生物堿和總黃酮明顯優(yōu)于多糖和桑葉其他部位，因此后續(xù)實驗選用生物堿和總黃酮進(jìn)行。見表3。

表3 不同桑葉提取物對糖尿病小鼠血糖的影響 ()

表3 不同桑葉提取物對糖尿病小鼠血糖的影響 ()

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

10 d模型組 等容積組 別 劑量/(生藥g·kg－1) 動物數(shù)/只 血糖/(mmol·L－1)給藥前 給藥后5 d 給藥后14.5±4.0 21.9±5.1 24.1±4.6格列苯脲 0.00195 8 15.6±6.4 14.8±7.3* 16.2±5.8多糖 20 9 15.9±5.9 17.3±6.2 19.2±5.5生物堿 20 11 15.1±4.5 11.9±8.0＊＊ 12.5±6.8＊＊總黃酮 20 8 15.0±5.0 12.3±5.5＊＊ 13.6±6.3*其他提取物 20 10 14.8±4.7 19.8±6.8 17.6±6.77*

2.2 應(yīng)用均勻設(shè)計試驗篩選桑葉提取物生物堿和總黃酮的最佳降血糖作用配比 與模型組比較，9個水平給藥組在給藥第5天后，除編號4組外，其余各給藥組均顯示出降糖效應(yīng)，與模型組比較差異有顯著性 (P＜0.05，P＜0.01)，第10天各給藥組均有降糖作用，與模型組比較差異有顯著性 (P＜0.05，P＜0.01)，其中降糖作用最好的是2、3組，結(jié)合藥材的合理應(yīng)用，本實驗選擇2組即總黃酮和總生物堿的比例為6∶1進(jìn)行下面的實驗。見表4。

2.3 桑葉生物堿+桑葉總黃酮對糖尿病小鼠血糖的影響與模型組相比，各給藥組在給藥第5天血糖值均有下降，除低劑量組外，其他各組均有顯著性 (P＜0.05，P＜0.01);給藥10 d后，各給藥組與模型組比較血糖值下降明顯，且有顯著性差異 (P＜0.01)。見表5。

表4 不同桑葉提取物配比對糖尿病小鼠血糖的影響 ()

表4 不同桑葉提取物配比對糖尿病小鼠血糖的影響 ()

注:與模型組比較，*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01

10 22.9±6.3 25.0±4.6 24.5±3.81200+125 12 23.1 ±5.3 17.6 ±4.5＊＊ 19.6 ±2.3＊＊2300+50 11 22.2 ±4.3 17.9 ±3.3＊＊ 15.9 ±3.9＊＊3400+175 12 23.6 ±6.5 17.3 ±7.7＊＊ 15.8 ±4.4＊＊4500+100 10 21.3±5.9 21.1±6.0 16.4±5.9＊＊5600+25 11 20.8 ±5.6 18.0 ±5.5＊＊ 18.5 ±4.2＊＊6700+150 11 22.6±6.6 17.4±6.4＊＊ 18.9±6.0*7800+75 10 23.1±5.7 19.2±5.4* 18.9±4.2＊＊8500+0 10 24.2±5.5 20.3±5.4* 17.6±6.5＊＊10 d模型組 等容積組 別 (黃酮+生物堿)/(mg·kg－1) 動物數(shù)/只 血糖/(mmol·L－1)給藥前 給藥5 d 給藥90+100 10 23.0±6.3 20.6±3.2* 20.5±2.0＊＊

表5 桑葉生物堿+桑葉總黃酮對糖尿病小鼠血糖的影響 ()

表5 桑葉生物堿+桑葉總黃酮對糖尿病小鼠血糖的影響 ()

注:與模型組比較，*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01

10 d模型組 等容積組 別 劑量/(mg·kg－1) 動物數(shù)/只 血糖/(mmol·L－1)給藥前 給藥后5 d 給藥后10 16.44±3.45 14.46±3.36 11.21±0.68阿卡波糖組 39 12 14.30±3.20 3.98±2.00＊＊ 7.91±2.44＊＊90+15 10 17.10±6.75 13.76±2.86 8.27±2.70＊＊桑葉總黃酮+總生物堿 180+30 11 14.68±3.43 9.09±5.71* 7.53±2.84＊＊360+60 10 15.05±5.87 4.29±3.01＊＊ 6.14±2.30＊＊

2.4 桑葉生物堿+桑葉總黃酮對正常小鼠糖耐量的影響

2.4.1 多糖糖耐量 給藥1 h后，0時血糖值各組間均無顯著性差異且血糖值極低;給淀粉0.5 h后各組血糖與0時血糖相比較均顯著升高，但空白組明顯比其余各組升高程度大，阿卡波糖與空白組相比較有顯著性的差異 (P＜0.01);給淀粉1 h后，血糖持續(xù)升高，各組升高程度仍低于空白組，其中阿卡波糖組和桑葉總黃酮+總生物堿 (360+60)mg/kg組與空白組相比較有顯著性的差異 (P＜0.05，P＜0.01);給淀粉2 h后，空白組血糖與給淀粉1 h后略有降低，其余各組略有升高，但升高程度仍低于空白組，且阿卡波糖組、桑葉總黃酮+總生物堿 (180+30)、(360+60)mg/kg組與空白組相比較有顯著性差異 (P＜0.05，P＜0.01)。見表6。

表6 桑葉生物堿+桑葉總黃酮對正常小鼠多糖糖耐量的影響 ()

表6 桑葉生物堿+桑葉總黃酮對正常小鼠多糖糖耐量的影響 ()

注:與模型組比較，*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01

0 h 0.5 h 1 h 2 h空白組 等容積組 別 劑量/(mg·kg－1) 動物數(shù)/只 血糖/(mmol·L－1)10 0.63±0.33 6.39±2.75 8.09±2.41 7.85±2.22阿卡波糖組 39 10 0.79±0.52 3.29±1.42＊＊ 5.32±1.94* 5.7±1.87*90+15 10 0.62±0.2 4.9±1.5 7.33±2.52 7.84±2.17桑葉總黃酮+總生物堿 180+30 10 0.62±0.66 4.97±1.36 6.01±2.1 5.65±1.55*360+60 10 0.65±0.84 5.16±1.48 4.46±1.21＊＊ 4.92±1.8＊＊

2.4.2 單糖糖耐量 給藥1 h后，0時血糖值各組間均無顯著性差異且血糖值極低;給葡萄糖0.5 h后各組血糖與0時血糖相比較均顯著升高，但空白組明顯比其余各組升高程度大，各給藥組與空白組相比較有顯著性的差異 (P＜0.01，P＜0.01);給淀粉1 h后，各組血糖開始降低，除桑葉提取物 (90+15)mg/kg組外，其余給藥組與空白組相比較有顯著性的差異 (P＜0.01);給淀粉2 h后，各組血糖繼續(xù)降低，空白組血糖與給淀粉1 h后相比略有降低，各給藥組與空白組相比較有顯著性差異 (P＜0.01)。見表7。

表7 桑葉生物堿+桑葉總黃酮對正常小鼠單糖糖耐量的影響 ()

表7 桑葉生物堿+桑葉總黃酮對正常小鼠單糖糖耐量的影響 ()

注:與模型組比較，*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01

0 h 0.5 h 1 h 2 h空白組 等容積組別 劑量/(mg·kg－1) 動物數(shù)/只 血糖/(mmol·L－1)10 0.39±0.51 7.89±1.31 4.11±0.83 3.99±0.62二甲雙胍組 130 10 0.23±0.26 4.49±2.07＊＊ 2.63±1.16＊＊ 2.63±0.57＊＊90+15 10 0.39±0.29 5.9±1.82* 3.54±1.59 3.06±0.75＊＊桑葉總黃酮+總生物堿 180+30 10 0.22±0.17 5.35±1.98* 2.88±0.93＊＊ 2.23±0.41＊＊360+60 10 0.34±0.18 5.22±1.6* 2.14±0.85＊＊ 1.55±0.98＊＊

3 討論

2007—2008年國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查顯示，20歲以上的成年人糖尿病患病率為9.7%［6］。如今更進(jìn)一步增多。糖尿病有多種并發(fā)癥，很多并發(fā)癥較難治愈［7-8］，而高血糖是這些并發(fā)癥的起始誘導(dǎo)因素，因此降低糖尿病患者的血糖就尤為重要。桑葉自古就是治療糖尿病的中藥，如今桑葉在臨床的應(yīng)用更為廣泛［3］。桑樹在中國種植多，分布廣。但由于不同地區(qū)的桑葉中的各種成分的量并不相同［2，5］，導(dǎo)致桑葉的應(yīng)用有很大的局限性。但若將桑葉中降血糖作用的有效部位提取分離并篩選出來，必將為臨床提供新的治療選擇。

有效部位的篩選試驗利用四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型，通過雙盲法篩選桑葉提取物中降血糖作用較好的部位［9］。結(jié)果表明，在桑葉的4個提取物中 (桑葉多糖、桑葉生物堿、桑葉總黃酮、桑葉其他提取物)，總生物堿和總黃酮降血糖的作用較其他提取物明顯。楊旭也對桑葉總生物堿進(jìn)行了提取并證明到了其具有較好的降糖作用［10］;陳玲玲等也研究了桑葉黃酮對糖尿病小鼠血糖的調(diào)節(jié)作用，桑葉黃酮能顯著降低糖尿病小鼠血糖［11］。大量的文獻(xiàn)均報道桑葉黃酮和桑葉生物堿均具有有良好的降糖作用［12-14］?？紤]到合用桑葉黃酮和生物堿后可能能提高降糖效果，降低藥物的用量，并提高藥材利用率，因此本實驗應(yīng)用均勻設(shè)計試驗法作驗證。

篩選實驗結(jié)束后，應(yīng)用二因素七水平均勻設(shè)計表將桑葉生物堿和桑葉總黃酮按不同配比合用給予糖尿病小鼠［9，15］，結(jié)果顯示不同配比的桑葉總黃酮和桑葉生物堿均能降低糖尿病小鼠血糖，其中又以編號2組［黃酮+生物堿 (300+50)］、編號3組 ［黃酮+生物堿 (400+175)］最優(yōu)，考慮到藥物的總用量及原藥材中總黃酮與總生物堿的得率比6∶1，因此后續(xù)試驗選取編號2組進(jìn)行 (總黃酮∶總生物堿為6∶1)。編號2組中小鼠灌胃量為總黃酮300 mg/kg+生物堿為50 mg/kg，轉(zhuǎn)換為生藥量為:總黃酮300 mg/kg÷12 mg/g=25 g/kg，總生物堿 50 mg/kg÷2 mg/g=25 g/kg。因此編號2組小鼠給藥量按生藥計算為25 g/kg。這與第一步篩選時，4種提取物單用時的給藥計量20 g/kg也較為接近。后續(xù)試驗仍用此配比進(jìn)行，并設(shè)計了按桑葉總黃酮和總生物堿計算的 (90+15)mg/kg、(180+30)mg/kg、(360+60)mg/kg三個劑量組。

本實驗應(yīng)用糖尿病小鼠模型降糖試驗和正常小鼠糖耐量實驗驗證了總黃酮 ∶總生物堿為6∶1應(yīng)用后的作用，該有效部位的組合能降低糖尿病小鼠血糖，提高正常小鼠對淀粉和葡萄糖的耐受能力，并存在劑量的依賴性。說明桑葉生物堿和總黃酮在合并應(yīng)用后具有較好的降糖效果，同樣說明桑葉提取物降低血糖的機制并不唯一，可能通過抑制糖苷酶，進(jìn)而抑制雙糖的分解和吸收，也可能直接提高了胰島素的敏感性，抑制了葡糖糖在腸道的吸收。合并后的桑葉提取物降血糖的機制和優(yōu)勢有待于進(jìn)一步研究。本研究為桑葉臨床治療糖尿病提供科學(xué)依據(jù)，可為防治糖尿病藥物的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

［1］陳菁菁，李向榮.微波萃取法提取桑葉和桑白皮的黃酮類成分［J］.中草藥，2006，29(10):1090-1092.

［2］林天寶，李有貴，俞黎曉，等.不同桑品種桑葉多糖含量和組成的初步比較分析［J］.蠶桑通報，2008，39(1):19-21.

［3］滕美春，張如馬，健 雄，等.桑葉活性成分及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.北方藥學(xué)，2013，12(2):66-67.

［4］張 歐，譚志平，李顏屏.中藥桑葉的藥理作用及其臨床應(yīng)用分析［J］.中國醫(yī)藥指南，2013，11(6):265-266.

［5］劉 凡，李平平，廖森泰，等.98份不同桑樹品種資源的桑葉總生物堿及1-脫氧野尻霉素含量測定［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2012，38(2):185-191.

［6］Yang W，Lu J，Weng J，et al.Prevalence of diabetes among men and women in China［J］.N Engl J Med，2010，362(12):1090-1101.

［7］何 敏，胡仁明.慢性炎癥與糖尿病慢性并發(fā)癥［J］.中華糖尿病雜志，2013，5(9):569-572.

［8］仝小林.糖尿病血管并發(fā)癥中醫(yī)研究的策略［J］.中國臨床醫(yī)生，2013，41(10):703-705.

［9］徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學(xué)［M］.3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.

［10］楊 旭.桑葉中總生物堿提取工藝優(yōu)化及降血糖活性研究［D］.江蘇:南京理工大學(xué)，2012.

［11］陳玲玲，劉 煒，陳建國，等.桑葉黃酮對糖尿病小鼠調(diào)節(jié)血糖的作用機制研究［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2010，26(11):835-838.

［12］李先佳，任麗平，于海英，等.桑葉總黃酮對2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞氧化損傷的影響［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32(6):701-704.

［13］劉英華，薛長勇，王 覲，等.桑葉黃酮對小鼠餐后血糖的影響及對α-葡萄糖苷酶抑制作用［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2009，43(1):80-82.

［14］侯瓊芳，彭瑞光.桑葉總黃酮提取及降血糖作用研究［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29(16):2414-2416.

［15］張 源，董鴻曄.均勻設(shè)計與正交設(shè)計聯(lián)用方法在藥學(xué)實驗中的應(yīng)用［J］.中國醫(yī)藥指南，2013，11(18):787-788.