吳傳云，阮迪云，董昌武，吳云龍，周雪梅，王建青

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，安徽 合肥 230038;2.中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)院，安徽 合肥 230027)

WHO Prues博士的調(diào)查表明，全球有近半數(shù)5歲以下兒童的血鉛水平超過(guò)10 μg/dL，其形勢(shì)在發(fā)展中國(guó)家尤為嚴(yán)峻［1］。鉛中毒在我國(guó)的流行率高達(dá)30% ～50%，而且有顯著的地域差異［2-3］。

產(chǎn)前和早期鉛暴露影響新生兒的體重身高及胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育［4-5］。鉛改變了多巴胺能、膽堿能和谷氨酸能的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［6］，只要血鉛水平達(dá)到10 μg/dL，就可能會(huì)導(dǎo)致腎小管損傷、神經(jīng)生理和認(rèn)知缺陷、聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)和兒童生長(zhǎng)發(fā)育障礙［7-8］。但更多的研究證明，即使兒童血鉛水平低于10 μg/dL，也會(huì)有認(rèn)知、視覺(jué)、運(yùn)動(dòng)及聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的功能減退［9-10］。兒童的血鉛水平與智商(IQ)顯著相關(guān)，血鉛水平每上升30～40 μg/dL，IQ值就會(huì)降低4～6分，并伴有認(rèn)知功能和心理行為的改變。發(fā)育早期嚴(yán)重鉛中毒會(huì)引起腦功能的不可逆損傷。

本研究通過(guò)具有滋陰填精、益氣壯陽(yáng)作用的龜鹿二仙膠對(duì)出生后鉛暴露大鼠血鉛、海馬鉛、CA1區(qū)突觸可塑性的影響，探討龜鹿二仙膠修復(fù)鉛致學(xué)習(xí)記憶功能損傷的機(jī)制，為兒童鉛中毒的中醫(yī)藥防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)所用SD大鼠由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):scxk(皖)2011-002，盡所有的努力，減少所用動(dòng)物的數(shù)量及其痛苦。嚴(yán)格控制環(huán)境溫度 (24±1)℃及相對(duì)濕度 (50±10)%，保持通風(fēng)，并維持每天都有12∶12的白晝黑夜節(jié)律。

本實(shí)驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)室以前用過(guò)的鉛暴露模型［11］，分娩當(dāng)天將仔鼠隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組:(1)正常組;(2)正常+龜鹿二仙膠組;(3)鉛組;(4)鉛+龜鹿二仙膠組。鉛組、鉛+龜鹿二仙膠組母鼠在哺乳期間，仔鼠從第21天斷奶到第60天，一直飲用含有0.2%(1090 mg/kg)的醋酸鉛的飲用水，而其它對(duì)照組大鼠一直飲用去離子水。出生后第60天，測(cè)定血鉛水平，判斷鉛中毒程度。用中藥 (龜鹿二仙膠，1.17 g/kg)給正常+龜鹿二仙膠組及鉛+龜鹿二仙膠組的仔鼠灌胃2周，同時(shí)給正常組的仔鼠以0.9%生理鹽水灌胃。隨后進(jìn)行電生理記錄實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)確保每組動(dòng)物雌雄數(shù)目相同。

1.2 血液和海馬鉛水平測(cè)定 電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后心臟取血2 mL，所有的樣品均保留一式兩份。采用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)血鉛。在整個(gè)測(cè)定過(guò)程中一直要嚴(yán)格控制外源性鉛污染。按步驟嚴(yán)格進(jìn)行鉛標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控及樣品吸光度值測(cè)定，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出血鉛水平?？焖賱?nèi)?shí)驗(yàn)大鼠的海馬立即冷藏，以備測(cè)海馬鉛水平用。采用液態(tài)等離子質(zhì)譜儀 (VG Elemental，UK)分析硝解后的海馬樣本，測(cè)定鉛水平。

樣品處理過(guò)程:在洗凈并蒸干的玻璃小燒杯中稱量樣品，加入2 mL的MOS級(jí)濃HNO3，低溫加蓋加熱樣品溶液至近干，補(bǔ)加HNO31 mL及5滴MOS級(jí)濃HClO4，繼續(xù)加蓋加熱至燒杯內(nèi)白煙冒盡，期間不斷搖晃燒杯，使燒杯內(nèi)溶液分布均勻，以免局部過(guò)度受熱結(jié)碳，冷卻，加上述HNO34滴及少量水，充分振蕩搖勻，定容為 5.00 mL，待測(cè)。

1.3 海馬CA1區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng) (LTP)的在位電生理記錄 海馬場(chǎng)電位記錄按文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行［12-14］。采用腹腔注射1.8 g/kg 10%烏拉坦麻醉大鼠，在實(shí)驗(yàn)需要時(shí)可補(bǔ)充至外科水平。將其頭部固定在立體定位儀 (江灣1型)上，暴露頭骨。監(jiān)測(cè)直腸溫度，用自動(dòng)加熱墊維持在 (37±0.5)℃。用雙極鎢絲電極作刺激電極，定位于CA1區(qū)海馬薛氏側(cè)枝/聯(lián)合纖維(前囟后4.2 mm，中縫右旁3.8 mm，深度約2.8 mm)，記錄電極定位于海馬CA1區(qū)的近端樹(shù)突層 (前囟后3.4 mm，中縫右旁2.5 mm，深度約2.0 mm)。該套管包括兩個(gè)相互隔離的鎢絲電極 (特氟龍酯覆蓋厚度為230 μm)和一個(gè)引導(dǎo)管 (尺寸為26號(hào))。兩鎢絲電極黏附在不銹鋼的引導(dǎo)管兩側(cè)，從引導(dǎo)管末端伸出800 μm。將引導(dǎo)管的內(nèi)管 (尺寸為31號(hào))插入到海馬CA1區(qū)記錄位點(diǎn)上方約300 μm處。將內(nèi)管通過(guò)聚乙烯管連接微量注射器 (Hamiltonsyringe，10 μL)。來(lái)源于CA1區(qū)的電信號(hào)被放大1000倍，濾波帶寬為1～3 kHz，在10 kHz數(shù)值化。記LTP時(shí)，刺激強(qiáng)度調(diào)整為最大場(chǎng)興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)的40%～50%時(shí)的強(qiáng)度。強(qiáng)直刺激前記錄20 min基線 (變化幅度＜10%)。強(qiáng)直刺激的參數(shù)設(shè)定為:主間隔1 s，即每隔1 s給一串刺激，每串包括200 Hz，20個(gè)pulse，共給5個(gè)串，隔1 min重復(fù)6次。在強(qiáng)直刺激后恢復(fù)之前的單脈沖刺激并記錄1 h以上。

1.4 試驗(yàn)藥物 龜鹿二仙膠由澳門同福堂黃家濟(jì)志藥行生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)HKP-05148。所用試劑質(zhì)量均為最高等級(jí)，所有溶液均在實(shí)驗(yàn)前臨時(shí)配制。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析 把以fEPSP的起始斜率作為參數(shù)來(lái)衡量實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的大小，將20 min的基線反應(yīng)作為平均的基值 (100%)，高頻刺激后60 min的fEPSP幅度疊加的平均值除以高頻刺激前基線反應(yīng)的平均基值的結(jié)果是LTP的幅度。實(shí)驗(yàn)所取得的電生理數(shù)據(jù)均用 Igor 4.0(Wave Metrics，OR，USA)分析獲得，然后用Origin 8.0(OriginLab，MA，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。所有數(shù)據(jù)結(jié)果均采用均數(shù) (Mean)±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差 (Standaxd Error Mean，SEM)表示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用One-way ANOVA分析，Bonferroni test矯正，以P＜0.05為有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 龜鹿二仙膠不能降低染鉛大鼠的血鉛水平實(shí)驗(yàn)各組大鼠全血血鉛水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1?？梢钥闯?，染鉛組大鼠血鉛水平比正常對(duì)照組明顯升高，有顯著性差異 (P＜0.01);而同期龜鹿二仙膠治療組血鉛水平比染鉛組沒(méi)有明顯降低，表明龜鹿二仙膠沒(méi)有降血鉛作用。提示龜鹿二仙膠對(duì)于鉛中毒的修復(fù)作用可能不是通過(guò)降血鉛來(lái)完成的。

表1 龜鹿二仙膠對(duì)鉛鼠血鉛水平的影響Tab.1 Effects of Guilu Erxian Gel on blood lead level in lead-exposed rats

2.2 龜鹿二仙膠部分降低染鉛大鼠的海馬鉛水平 實(shí)驗(yàn)各組海馬鉛水平詳細(xì)列在表2中，染鉛組的海馬鉛水平明顯高于正常對(duì)照組 (P＜0.01)，表明本實(shí)驗(yàn)鉛暴露模型的成功，用龜鹿二仙膠治療2周后海馬鉛水平與鉛組有顯著差異 (P＜0.01)，但仍高于正常組 (P＜0.01)。這些檢測(cè)結(jié)果表明，慢性鉛暴露增加了大鼠海馬鉛水平，而龜鹿二仙膠的干預(yù)可以部分減少由此引起的海馬鉛水平的上升。

表2 龜鹿二仙膠對(duì)鉛鼠海馬鉛水平的影響Tab.2 Effects of Guilu Erxian Gel on hippocampal lead level in lead-exposed rats

2.3 龜鹿二仙膠對(duì)染鉛大鼠海馬CA1區(qū)LTP損傷有部分修復(fù)作用 圖1顯示的是龜鹿二仙膠對(duì)正常組、鉛組、正常+龜鹿二仙膠組、鉛+龜鹿二仙膠組大鼠LTP的誘導(dǎo)和維持的影響。正常組(195.8%±10.8%，n=8)與正常+龜鹿二仙膠組 (199.7%±14.3%，n=8)LTP幅度無(wú)顯著差異 (P＞0.05)。提示龜鹿二仙膠對(duì)正常對(duì)照組海馬CA1區(qū)LTP的幅度沒(méi)有影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鉛組大鼠LTP的幅度顯著下降到 (145.7% ±11.7%，n=7)(P＜0.01)，雖然鉛鼠經(jīng)過(guò)龜鹿二仙膠治療后的LTP幅度 (175.6%±10.8%，n=7)明顯高于鉛組 (P＜0.05)，但仍低于正常組的LTP幅度(P＜0.05)。這些結(jié)果表明，在大鼠發(fā)育期鉛暴露時(shí)，龜鹿二仙膠能夠在一定程度上保護(hù)但不能完全逆轉(zhuǎn)鉛誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)LTP的損傷，龜鹿二仙膠部分修復(fù)了慢性鉛暴露組LTP幅度的損傷。

圖1 龜鹿二仙膠對(duì)鉛鼠海馬CA1區(qū)LTP損傷的影響Fig.1 Effects of Guilu Erxian Gel on lead-induced LTP impairment in the CA1area

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)是鉛中毒的主要攻擊目標(biāo)?？茖W(xué)家們推測(cè)，正是由于胎兒大腦的血腦屏障未發(fā)育完全并且缺乏能結(jié)合鉛的某些保護(hù)性組織蛋白，才使得它特別易于受到鉛毒性的影響［15］。本研究旨在驗(yàn)證鉛中毒導(dǎo)致的智力損傷可以用龜鹿二仙膠加以預(yù)防這一假設(shè)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了龜鹿二仙膠對(duì)鉛暴露組大鼠海馬SC-CA通路LTP損傷有一定的修復(fù)作用。

中醫(yī)認(rèn)為鉛味甘，性寒，有小毒。鉛性寒，為陰邪，易傷陽(yáng)氣，導(dǎo)致脾腎陽(yáng)虛證，終則陰陽(yáng)兩虛。未成年人鉛中毒當(dāng)屬腎精不足證，多因先天稟賦不足 (由母體染毒)，或后天失養(yǎng) (后天染毒)，小兒腎精不充，不能主骨生髓充腦，不能化生氣血，生長(zhǎng)肌肉，則發(fā)育遲緩，身材矮小，囟門遲閉，智力低下，骨骼萎軟，動(dòng)作緩慢，腰酸，健忘。本研究以此為理論依據(jù)，治療時(shí)選擇具有滋陰填精益氣壯陽(yáng)作用的龜鹿二仙膠。方劑由鹿角、龜甲、枸杞子、人參組成，龜鹿皆靈而有壽，可補(bǔ)腎、補(bǔ)血、補(bǔ)精、補(bǔ)氣，再加上人參、枸杞，益氣生精，諸藥相配，能補(bǔ)陰益陽(yáng)，延年益壽，生精補(bǔ)腎。

海馬是鉛的最重要的靶組織，也是學(xué)習(xí)記憶所必需的腦結(jié)構(gòu)。迄今為止，公認(rèn)的學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)是突觸可塑性，長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng) (LTP)是最經(jīng)典的突觸可塑性的細(xì)胞模型［16］。海馬牽涉到外顯記憶，并在記憶的編碼和形成中起關(guān)鍵作用［17］。海馬包括三個(gè)分區(qū):CA1區(qū)，CA3區(qū)和 DG區(qū)，確切的說(shuō)，CA1區(qū)是海馬空間記憶的重要區(qū)域，學(xué)習(xí)記憶以突觸可塑性的形式在這里在編碼，鞏固和儲(chǔ)存［18-19］。突觸可塑性依賴于不同突觸前、后神經(jīng)元機(jī)制及其周圍的膠質(zhì)細(xì)胞，記憶的產(chǎn)生涉及突觸可塑性的持續(xù)性變化，突觸前后的許多成分參與了LTP的產(chǎn)生。許多研究表明鉛損傷了發(fā)育期大鼠海馬的CA1區(qū)和齒狀回的LTP的誘導(dǎo)，幅度和維持時(shí)間［20-22］。在本實(shí)驗(yàn)中也取得了類似的結(jié)果，鉛組大鼠LTP的幅度明顯下降。

龜鹿二膠中含有豐富的微量元素鋅，有研究表明，補(bǔ)鋅可拮抗慢性鉛暴露導(dǎo)致的血及海馬中鉛含量的升高，增加海馬中BDNF mRNA的表達(dá)，并可減輕鉛對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的損傷［23-24］。本研究中，發(fā)育期鉛暴露組與正常對(duì)照組相比，血鉛水平顯著增加。這些血鉛水平類似于本課題組以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［22］。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠可以部分降低海馬鉛水平，雖然沒(méi)能降低血鉛水平，但這可能和鉛的代謝特點(diǎn)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證實(shí)了龜鹿二仙膠可以部分修復(fù)鉛導(dǎo)致的LTP的幅度降低，提示龜鹿二仙膠可能對(duì)慢性鉛暴露引起的智力損傷有正面影響。以上實(shí)驗(yàn)證明，龜鹿二仙膠能保護(hù)發(fā)育期大鼠的突觸可塑性免受出生后鉛暴露引起的損傷。關(guān)于龜鹿二仙膠對(duì)鉛致智力損傷的修復(fù)機(jī)理還需要進(jìn)一步進(jìn)行更深層次的研究。龜鹿二仙膠與不同程度鉛中毒及不同發(fā)育期的鉛中毒之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以論證。

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