顧 帆，顧月清

(中國藥科大學(xué)，江蘇南京 210009)

駱駝蓬Peganum harmala L.是多年生草本蒺藜科駱駝蓬屬植物，是我國維族、蒙古族常用藥材，被列入衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾族分冊(cè)。主要分布于我國西北地區(qū)，在中東、中亞、地中海沿岸、南美也有分布。駱駝蓬性平，味苦、辛，有毒，具有堅(jiān)固筋脈、助陽暖陰、消散寒濕氣等功能，主治筋脈軟弱、骨關(guān)節(jié)痛、咳嗽痰多、偏癱健忘、神昏頭痛、月經(jīng)不調(diào)等癥［1］。種子和全草均具有藥用價(jià)值，其主要活性成分有去氫駱駝蓬堿 (harmine)、駱駝蓬堿 (harmaline)和去甲駱駝蓬堿 (harmalol)等。

去氫駱駝蓬堿 (7-甲氧基-1-甲基-9H-吡啶并［3，4-b］吲哚，harmine)，又稱肉葉云香堿，淡黃色針狀晶體，分子量為212.25，分子式為Cl3H12N20，是一種三環(huán)β-咔啉類生物堿，結(jié)構(gòu)式如圖一所示。harmine在自然界中分布廣泛，包括各種植物、海洋生物、昆蟲等，最早于1874年被人們從植物Peganum harmala的種子中提取得到。它在駱駝蓬種子中的含量較高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。研究表明，harmine具有抗菌、抗瘧原蟲、抗真菌、抗氧化、抗腫瘤、抗誘變、細(xì)胞毒、致幻等一系列藥理作用［2］。

圖1 去氫駱駝蓬堿的結(jié)構(gòu)

1 Harmine的抗腫瘤作用

隨著對(duì)harmine單體化合物藥理作用研究的進(jìn)一步深入，越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)該化合物對(duì)多種腫瘤模型具有明確的抑制作用。

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，harmine對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa、S-180、胃癌細(xì)胞 MGC-803和 HGC27、肝癌細(xì)胞 BEL-7402、鼻咽癌細(xì)胞CNE-2、人胰腺癌細(xì)胞AsPC-1、白血病細(xì)胞K562、小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞Colon26等多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用［3］。Jahaniani等采用MTT法檢測(cè) harmine的抗癌活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人類腫瘤細(xì)胞 (HL60，K562，HeLa，KB，A549，Saos-2，A2780-CP，A2780-S，MCF-7，A375，A172等)具有廣泛的細(xì)胞毒性［4］。

Liu等研究表明，harmine鹽酸鹽能夠顯著阻礙初級(jí)及次級(jí)神經(jīng)球形成，誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞GSLCs分化，并降低GSLCs的干性，發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用［5］。而在Zhang等的研究中，harmine表現(xiàn)出對(duì)胃癌細(xì)胞遷移與侵襲的抑制效果［6］。

體內(nèi)抗腫瘤研究結(jié)果表明，harmine對(duì)S-180小鼠、網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤L2和小鼠肝癌都有顯著的療［7］;可通過抑制血管形成，抑制裸鼠的肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞異種移植瘤［8］;對(duì)大鼠體內(nèi)接種的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤也有較好的生長(zhǎng)抑制效果［6］。

另外，harmine與順鉑、阿霉素聯(lián)用具有協(xié)同抗腫瘤效果［9］。與米托蒽醌、喜樹堿等聯(lián)用，能夠通過減少細(xì)胞BCRP(乳腺癌耐藥蛋白)依賴的外排作用，大幅度降低它們對(duì)BRCP高表達(dá)細(xì)胞的半數(shù)抑制率 (IC50)，恢復(fù)其對(duì)抗癌藥物的敏感性［10］。

2 Harmine誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用

細(xì)胞凋亡 (apoptosis)是細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)的一種形式，即在一定生理病理?xiàng)l件下，機(jī)體通過基因水平的調(diào)控，使細(xì)胞主動(dòng)死亡以維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過程，于1972年由Kerr等根據(jù)形態(tài)學(xué)特征首次提出［11］。

2.1 Harmine誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法 隨著技術(shù)的進(jìn)步，新的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)，對(duì)于凋亡細(xì)胞的檢測(cè)趨近快速而準(zhǔn)確。大量研究通過多種檢測(cè)手段，例如形態(tài)學(xué)觀察、電泳法、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法、流式細(xì)胞技術(shù)等，確證了harmine能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式發(fā)揮抗腫瘤效果。

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察 凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化包含以下幾個(gè)方面的特征:細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，核染色質(zhì)固縮于核膜邊緣，DNA降解，多個(gè)凋亡小體形成，并被周圍細(xì)胞吞噬消化［12-13］。劉俊玲等研究發(fā)現(xiàn)，harmine作用Jurkat細(xì)胞48 h后細(xì)胞后，進(jìn)行Wright-Giemsa染色，觀察形態(tài)發(fā)生了明顯改變，染色質(zhì)分布不均，呈致密濃染的塊狀，核膜增厚，核固縮碎裂，細(xì)胞形態(tài)基本完整。而未加藥物組細(xì)胞體積大，外形較規(guī)則，核呈圓形或橢圓形，核染色質(zhì)疏松細(xì)致，呈藍(lán)紫色，核仁大而清晰，胞漿豐富［14］。李強(qiáng)等使用Hoechst 33258染色可見，harmine作用后的HepG-2發(fā)生細(xì)胞核固縮邊聚裂解，凋亡小體形成等凋亡形態(tài)學(xué)變化［9］。Hamsa等以蘇木精、署紅染色B16F-10細(xì)胞后觀察，細(xì)胞膜起泡、染色質(zhì)濃縮、DNA碎裂，同樣有凋亡小體出現(xiàn)［15］。

2.1.2 電泳法 凋亡發(fā)生時(shí)Ca2+和Mg2+水平升高可激活細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶，導(dǎo)致細(xì)胞核DNA雙鏈斷裂，形成180～200 bp的整數(shù)倍的寡核苷酸片段，通過瓊脂糖凝膠電泳可以觀察到典型的梯型條帶。利用這種現(xiàn)象，DNA梯形條帶法至今仍作為最可靠的凋亡檢測(cè)手段被廣泛應(yīng)用［16］。研究人員從 harmine作用的 HepG-2、B16F-10、SGC-7901、Jurkat、U937、HL-60等細(xì)胞中抽提得到DNA，電泳后均呈現(xiàn)不連續(xù)DNA的梯狀連續(xù)條帶，表明片段化的形成，證實(shí)了 harmine 誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生［15，17-19］。

單細(xì)胞凝膠電泳 (Single cell gel electrophoresis)又稱彗星實(shí)驗(yàn) (Comet assay)。細(xì)胞經(jīng)裂解后，受損的DNA能在堿性電泳液作用下解旋后產(chǎn)生DNA斷片，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)彗星影像。反之，未受損傷的DNA，染色后呈圓形斑點(diǎn)無拖尾現(xiàn)象。Boeira等采用彗星實(shí)驗(yàn)考察了harmine誘導(dǎo)V79細(xì)胞凋亡的作用，與對(duì)照組相比，harmine在所有濃度下均表現(xiàn)出凋亡特有的DNA損傷指數(shù)以及損傷頻率顯著提升的趨勢(shì)［20-21］。

2.1.3 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL assay，Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay)的原理是利用凋亡細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂或一條鏈出現(xiàn)缺口，產(chǎn)生一系列3'-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 (TdT)作用下，將脫氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'末端，從而進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。相反，正常細(xì)胞因?yàn)閹缀鯖]有DNA斷裂缺口，所以不產(chǎn)生3'-OH，無法被染色［16］。Hamsa等利用TUNEL法檢測(cè)harmine給藥后B16F-10細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，觀察到大量TUNEL陽性細(xì)胞 (判定為凋亡細(xì)胞)，并通過觀察進(jìn)一步確認(rèn)了凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞核濃縮現(xiàn)象［15］。

2.1.4 流式細(xì)胞技術(shù) 流式細(xì)胞技術(shù)可以作為定性和定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法，具有操作簡(jiǎn)單、快速和敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，該法的基本原理是細(xì)胞在通過流式細(xì)胞儀激光焦點(diǎn)時(shí)可以發(fā)生光散射，產(chǎn)生前向散射光 (FSC)和側(cè)向散射光 (SSC)，前者強(qiáng)度與細(xì)胞大小有關(guān)，后者強(qiáng)度與質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部的折射率有關(guān)。凋亡細(xì)胞的FSC減小，而SSC增大;壞死的細(xì)胞FSC和SSC都會(huì)增大;而正常細(xì)胞FSC增大，SSC減小。因此，通過對(duì)散射光的分析，可以對(duì)三種細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和區(qū)分［16］。李強(qiáng)等用Annexin V-PI雙染法檢測(cè)HepG-2細(xì)胞早期凋亡率，加藥組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰，隨著harmine濃度的增大，HepG-2細(xì)胞的亞二倍體百分率增加，表明harmine可能是通過啟動(dòng)凋亡途徑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖的。而僅用PI染色的HepG-2細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示S期及G2/M期數(shù)量提升，同時(shí)G0/G1期數(shù)量下降，即harmine對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生G2/M期阻滯效果［17］。宋震亞等用harmine作用于SGC-7901細(xì)胞后進(jìn)行PI染色，通過流式細(xì)胞儀測(cè)得細(xì)胞周期的G1期前亞二倍體的凋亡峰均顯著增強(qiáng)，顯示harmine對(duì)SGC-7901細(xì)胞具有明顯的促進(jìn)凋亡作用［18］。張曉凱等將harmine作用于胰腺癌AsPC-1細(xì)胞，經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染后由流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，各組給藥細(xì)胞的晚期凋亡及壞死細(xì)胞群均顯著增多［22］。

2.2 Harmine誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制 harmine誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制雖然尚未得到完整確切的闡明，但harmine對(duì)參與細(xì)胞凋亡的一系列重要調(diào)控分子 (如caspase、bcl-2、p53、PARP等)所產(chǎn)生的作用受到了研究者們的廣泛關(guān)注。

2.2.1 Caspase與凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至少存在內(nèi)、外源性兩條途徑。內(nèi)源性途徑中，線粒體受到細(xì)胞內(nèi)外傳來刺激，釋放細(xì)胞色素C并與Apaf-1形成多聚體，繼而連續(xù)激活caspase-9以及caspase-3，啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。外源性途徑包括TNFR途徑與Fas/FasL途徑，分別經(jīng)由caspase-8與FADD的激活，啟動(dòng)下游的caspase相關(guān)蛋白酶活化反應(yīng)［24］?？梢奵aspase家族蛋白，尤其是caspase-3和caspase-8，在腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的各個(gè)階段廣泛發(fā)揮著不可替代的作用［23-24］。Cao等采用Western-Bloting法考察了harmine作用HepG-2細(xì)胞后的蛋白表達(dá)情況，可以觀察到caspase-3和caspase-9的前體裂解與活化［17］。張曉凱等發(fā)現(xiàn)在AsPC-1細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)也能被harmine抑制［22］。而采用RT-PCR考察mRNA基因表達(dá)分析顯示，harmine作用后的 B16F-10后，caspase-3、caspase-8和caspase-9的表達(dá)在給藥后短時(shí)間內(nèi)即顯著提升［15］。上述結(jié)果表明harmine對(duì)內(nèi)、外源性的細(xì)胞凋亡通路上caspase分子都能產(chǎn)生作用，并且可能是凋亡機(jī)制的啟動(dòng)誘導(dǎo)因素。

2.2.2 bcl-2基因 bcl-2家族分為抗凋亡基因 (bcl-2、bcl-xL、Mcl-1等)和促凋亡基因 (Bax、Bid等)兩類。它們調(diào)節(jié)線粒體PT孔的開放與閉合，從而控制線粒體跨膜電位的變化，在凋亡途徑中發(fā)揮至關(guān)重要作用［25-26］。研究表明，harmine作用于白血病細(xì)胞U937、HL-60、Jurket細(xì)胞后，隨藥物濃度的增大bcl-2蛋白的表達(dá)量降低，提示Bcl-2在harmine誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑中是重要的調(diào)控因子［19］。bcl-2與Bax蛋白量的比率決定異二聚體(bcl-2/Bax)與同二聚體 (Bax/Bax)的比值，這對(duì)決定細(xì)胞凋亡的易感性起關(guān)鍵作用，是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”［27-28］。harmine作用胃癌細(xì)胞 BGC-823以及 SGC-7901后，bcl-2表達(dá)量降低，而 Bax表達(dá)量提高。作用肝癌HepG-2細(xì)胞后，bcl-2、Mcl-1和bcl-xL的表達(dá)量降低，而不影響B(tài)ax，這些情況都導(dǎo)致bcl-2/Bax、Mcl-1/Bax與bclxL/Bax的比值降低［7，17］。因此對(duì) bcl-2家族的影響，既是harmine誘導(dǎo)凋亡效果的重要證據(jù)，也可能是主要的機(jī)制之一。

2.2.3 p53基因 p53是一個(gè)參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子，能對(duì)包括DNA損傷與癌基因激活等刺激做出反應(yīng)。當(dāng)這些刺激激活p53后，活化的p53激活其靶基因p21、p27、Bax和Bid等，增加細(xì)胞色素C的釋放，導(dǎo)致caspase-9激活，然后切割效應(yīng)caspase(如caspase-3)發(fā)揮作用繼而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞衰亡［29-30］。p53抑癌基因參與凋亡程序中幾乎所有主要步驟，是細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。MDM2(Murine double minute 2)是p53的主要調(diào)節(jié)分子，通過直接相互作用抑制p53的功能。Dai等采用免疫共沉淀法考察了p53與MDM2相互作用，結(jié)果表明與p53結(jié)合的MDM2表達(dá)量隨著harmine濃度的增加而大幅降低，內(nèi)源性p53表達(dá)量則被提高，表明harmine對(duì)內(nèi)源性p53與MDM2相互作用的抑制能力呈劑量依賴性。在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，harmine顯示出能夠保護(hù)p53不被蛋白合成抑制劑放線菌酮 (CHX)降解，提升p53穩(wěn)定性的作用［8］。同時(shí)，在B16F-10細(xì)胞中harmine還顯示出抑制p53及其靶基因mRNA表達(dá)的效果［15］。

2.2.4 NF-κB信號(hào)通路 NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通常被認(rèn)為是細(xì)胞存活的因素，參與死亡受體途徑并能激活 bcl-2、bcl-xL等抗凋亡基因。NF-κB蛋白家族包括一系列轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因因子在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和抗凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起決定性的作用［31-32］。通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA實(shí)驗(yàn))測(cè)定B16F-10細(xì)胞中NF-κB的亞單位p65、p50和c-Rel的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)harmine對(duì)細(xì)胞內(nèi)p65、p50和c-Rel的表達(dá)均表現(xiàn)出一定程度地抑制作用。這種對(duì)NF-κB激活抑制的作用可能由harmine對(duì)一系列促炎癥細(xì)胞因子 (TNF-α、IL-1β、IL-6和GM-CSF)的抑制而引起的［15］。

2.2.5 PARP酶 聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶 (Poly ADP-ribose polymerase，PARP)是一種DNA修復(fù)酶。是定位在細(xì)胞核內(nèi)，與應(yīng)激條件下DNA修復(fù)密切相關(guān)的一種酶。在體內(nèi)是caspase-3的主要剪切對(duì)象。RARP剪切被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)，也通常被認(rèn)為是caspase-3激活的指標(biāo)［33］。張曉凱等發(fā)現(xiàn) harmine作用 AsPC-1細(xì)胞，顯示PARP蛋白表達(dá)減少并被切割［22］。Dai等的研究顯示 HUVECs中PRAP蛋白的表達(dá)的減少、Cleaved PRAP表達(dá)量的增多也與harmine呈劑量依賴關(guān)系［8］。

2.2.6 核酸酶CAD 細(xì)胞凋亡通常伴隨著DNA的降解與染色質(zhì)固縮。除了人們?cè)缙谘芯堪l(fā)現(xiàn)的可以導(dǎo)致DNA斷裂的DNase I，DNaseII，DNaseγ以及Cyclophilins等因素以外，研究人員又發(fā)現(xiàn)了一種擁有這種活性的分子CAD及其抑制劑 ICAD［34］。CAD(Caspase-activated deoxyribonuclease)是一種能夠降解細(xì)胞DNA，并使染色質(zhì)固縮的一類核酸酶。通常情況下，CAD與ICAD以無活性的方式復(fù)合物方式存在，而凋亡細(xì)胞中活化的caspase-3可以切割CAD并消除其對(duì)CAD的抑制效果［35-36］。劉俊玲等研究發(fā)現(xiàn)，未藥物作用的Jurkat細(xì)胞高度表達(dá)ICAD，隨著harmine藥物濃度的增加，ICAD的表達(dá)量降低，表明harmine能夠通過抑制ICAD，在Jurkat細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑中發(fā)揮作用［14］。

2.2.7 細(xì)胞周期調(diào)控蛋白 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclins-dependent-kinases)和細(xì)胞周期蛋白Cyclins參與細(xì)胞周期調(diào)控。其復(fù)雜的活動(dòng)與細(xì)胞周期的各個(gè)環(huán)節(jié)的緊密相關(guān)［37］。作為p53基因的直接靶點(diǎn)，Cyclin A與CDK2結(jié)合后激活CDK2，促進(jìn)細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期，G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖，加速腫瘤的生長(zhǎng)侵潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。研究表明，細(xì)胞外的激酶實(shí)驗(yàn)以及在血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVES中，CDK2和Cyclin A均受到harmine抑制作用的影響［8］。同時(shí)，harmine對(duì)其他周期蛋白如 Cdk1、Cdk5、cyclinB1和CDC2也有類似的抑制效果［38］。

3 結(jié)語

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是個(gè)復(fù)雜生理病理現(xiàn)象，隨著對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制研究的逐步深入，人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)癌癥疾病進(jìn)程的重要作用。在傳統(tǒng)民間用藥積累的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，針對(duì)藥用植物中有效單體化合物的研究受到廣泛重視。駱駝蓬提取物harmine，在多種腫瘤細(xì)胞中被確證可以通過誘導(dǎo)凋亡在體內(nèi)外發(fā)揮抗腫瘤活性。而harmine對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上各步驟的關(guān)鍵酶以及重要調(diào)控分子的影響，可能是其誘導(dǎo)凋象的分子機(jī)制。相信隨著對(duì)harmine抗腫瘤作用機(jī)制研究的不斷深入，harmine將會(huì)成為癌癥化學(xué)治療的一種新選擇。

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