羅仕華，鄭傳勝*，黎維勇，衛(wèi)樂樂，王 勇，夏向文，周國鋒，馮敢生

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院放射科，湖北武漢 430022;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，湖北武漢 430022)

白及作為傳統(tǒng)中藥可以用來治療消化道黏膜損傷、潰瘍、出血、挫傷和燒傷，因而在東亞國家廣泛使用。白及多糖主要成分為由4分子甘露糖和1分子葡萄糖組成的葡配甘露糖［1］，屬高分子化合物，在水中溶解時(shí)受分子間氫鍵作用的影響，易形成親水性凝膠［2］，白及多糖的這一特性使其在臨床上有很好的治療作用。本課題組自上世紀(jì)以來對祖國傳統(tǒng)中藥白及進(jìn)行了系列的研究，證實(shí)白及提取物可作為各種血管栓塞劑的優(yōu)良載體，制作的白及微球及載藥微球還能通過抑制腫瘤新生血管生成及側(cè)支循環(huán)的建立發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。有文獻(xiàn)報(bào)道白及具有一定直接抗腫瘤作用并應(yīng)用于抗腫瘤研究［4］，但白及多糖對腫瘤細(xì)胞的具體作用未見報(bào)道，其作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取人胃癌細(xì)胞 (sgc)、人卵巢癌細(xì)胞 (A2780)、肝癌細(xì)胞(HepG2)，通過MTT法觀察和檢測純化的白及多糖對這3種腫瘤細(xì)胞生長的影響，并采用流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期變化，旨在探討白及多糖對腫瘤細(xì)胞生長的作用，為研究其抗腫瘤作用提供分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 Sgc、A2780、HepG2由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院介入放射科熊付博士惠贈(zèng);白及莖塊購于湖北省醫(yī)藥公司，經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中藥室鑒定，符合2010年版《中國藥典》的相關(guān)要求。三氯甲烷、正丁醇、無水乙二胺、環(huán)氧氯丙烷、液體石蠟、司盤85、吐溫80、異丙醇、丙酮、石油醚 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司武漢分公司，分析純)，DEAE-纖維素 (DE-52)100和Sephadex G-100(美國Whatman公司)，T-系列標(biāo)準(zhǔn)多糖 (美國Pharmacia公司)，考馬斯亮藍(lán) G-250為(美 國 Sigma 公 司);DMEM/HIGH GLUCOSE(SH30022.01B，美國Hyclone公司)，1640培養(yǎng)基 (美國Hyclone公司)，改良型RPMI-1640培養(yǎng)基 (SH30809.01B，美國Hyclone公司)，胎牛血清 (110311，杭州四季青公司)，胰酶 (0458，美國Amresco公司)，雙抗 (武漢谷歌生物公司)，D'hanks(1009，武漢谷歌生物公司)，MTT(Ns8180，北京索萊寶公司)和DMSO(0231，索北京萊寶公司)。核糖核酸酶RNase A(g2-R8021，武漢谷歌生物科技有限公司)，碘化丙啶PI染液 (g4-pi10，武漢谷歌生物科技有限公司)。

1.2 儀器 HH-4型恒溫水浴鍋 (江蘇金壇市宏華儀器廠)，RE-52型減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)，DZF-6021型真空干燥箱 (上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，LGJ冷凍干燥機(jī) (北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)，AUW220D電子天平 (日本島津公司)，離心機(jī) (北京醫(yī)用離心機(jī)廠);CO2恒溫培養(yǎng)箱 (MCO-15AC，日本SANYO公司)，潔凈工作臺 (SW-CJ-1FD，蘇凈安泰)，生物倒置顯微鏡(XDS-18，重慶水電儀器總公司)，倒置熒光顯微鏡(TE2000，日本Nikon公司)，酶標(biāo)檢測儀 (Rt2100c，美國Rayto)，離心機(jī) (TD2SO-2H，上海飛鴿)，不銹鋼滅菌鍋(DSX-280A，上海申安醫(yī)療設(shè)備)，照相機(jī) (fe5010，日本奧林巴斯)，流式細(xì)胞儀 (BD，F(xiàn)ACsort，美國 Becton-Dicknson公司)。

2 方法

2.1 白及多糖提取 白及莖塊加20倍體積蒸餾水，60℃回流提取4 h，重復(fù)提取1次，合并2次提取液，過濾，離心 (5000×g，10 min)，取上清液，加入相同體積石油醚，振蕩，取下層提取液，再加入2%活性碳，調(diào)節(jié)pH至3.5，40℃水浴30 min，過濾除去殘?jiān)?0℃減壓濃縮至較小體積，加3倍體積無水乙醇沉淀，離心 (5000×g，10 min)，取沉淀，溶于最小體積蒸餾水中，Savage法脫蛋白至無中間層析出為止，離心 (5000×g，10 min)，取上層清液。采用考馬斯亮藍(lán)G-250法檢測至無蛋白質(zhì)被測出。所得溶液對流水透析3 d，蒸餾水透析2 d，真空冷凍干燥。冷凍干燥后的白及多糖溶于蒸餾水，配成1%溶液，在陰離子交換纖維素DE-52柱上層析。先以多于一個(gè)柱體積的蒸餾水洗脫，而后分別用0.05、0.1、0.5 mol/L NaCl各500 mL進(jìn)行階段性洗脫，用自動(dòng)收集器每管10 mL收集，體積流量為2 mL/min，蒽酮-硫酸法檢測，得到一水洗組分，收集該組分，對流水透析，冷凍干燥。冷凍干燥后的白及多糖溶于蒸餾水中，離心 (5000×g，10 min)，取上清，上Sephadex G-100柱，以0.02 mol/L NaCl洗脫，體積流量0.5 mL/min，3 mL收1管，蒽酮-硫酸法檢測，得一多糖洗脫峰，收集該洗脫峰，對流水透析，冷凍干燥得純化白及多糖，計(jì)算多糖平均得率 ［(純化白及多糖質(zhì)量/樣品總質(zhì)量)×100%］。

2.2 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) Sgc采用1640培養(yǎng)基，A2780和HepG2采用DMEM高糖培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長，用0.25%的胰酶消化傳代，用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

2.3 白及多糖對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用 將對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消化后配制成密度為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按10000細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔加200 μL。然后將平板置37℃、5%CO2濕度培養(yǎng)箱中24 h后，于24、48、72 h分別加入各個(gè)細(xì)胞樣品對應(yīng)的白及多糖(50、100、200、400 μg/mL)的培養(yǎng)基，每個(gè)樣本質(zhì)量濃度設(shè)定平行的3個(gè)孔，對照組加不含白及多糖的培養(yǎng)液200 μL，再放入培養(yǎng)箱中孵育。每孔加入用按5 mg/mL新鮮配制的MTT溶液50 μL，孵育4 h，使MTT還原為甲瓚，當(dāng)在倒置顯微鏡下看到孔板內(nèi)的細(xì)胞周圍出現(xiàn)絲狀紫色結(jié)晶體時(shí)去除上清液，每孔加二甲基亞砜200 μL，當(dāng)平板搖床搖勻后，再使用酶標(biāo)儀測定光密度值 (檢測波長570 nm)，以溶劑對照處理細(xì)胞為對照組，按公式計(jì)算白及多糖對細(xì)胞的抑制率。抑制率 =(1－實(shí)驗(yàn)組/空白組)×100%。

2.4 腫瘤細(xì)胞周期分布 收集作用到72 h，白及多糖處理質(zhì)量濃度為200 μg/mL的腫瘤細(xì)胞，每種細(xì)胞設(shè)為2組，即空白對照組與實(shí)驗(yàn)組，用70%乙醇4℃固定過夜，PBS洗兩遍，加入100 μg/mL RNA酶，37℃消化30 min，酶切RNA;加50 μg/mL碘化丙啶，避光4℃染色30 min后，用流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算出腫瘤細(xì)胞周期分布。

3 數(shù)據(jù)處理

4 結(jié)果

4.1 白及多糖對3種腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用 提取的白及多糖為乳白色無嗅無味粉末，常溫下微溶于水，溶于熱水，不溶于有機(jī)溶劑，其水溶液幾乎為無色透明狀。DE-52柱層析得到一水洗脫多糖組成成分，再經(jīng)Sephadex G-100柱層析均呈單一的對稱峰，表明樣品為均一組成成分，白及多糖的平均得率為 (1.9±0.2)%。白及多糖對3種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率具有時(shí)間及劑量依賴性，不同質(zhì)量濃度的白及多糖與腫瘤細(xì)胞一起培養(yǎng)后，白及多糖對3種腫瘤細(xì)胞的生長均有抑制 (圖1～3)。隨著與白及多糖培養(yǎng)時(shí)間的延長，白及多糖質(zhì)量濃度的增高，對腫瘤細(xì)胞的抑制率越高，但白及多糖質(zhì)量濃度過高時(shí)，抑制率并不能繼續(xù)增高。經(jīng)計(jì)算，72 h后白及多糖對 sgc、A2780、HepG2的IC50分別為:26.5 μg/mL、65.7 μg/mL、3.7 ×1012μg/mL，由此可知，在3種腫瘤細(xì)胞中，白及多糖對sgc的抑制作用最強(qiáng)，對HepG2的抑制作用較小。

圖1 白及多糖對胃癌細(xì)胞抑制率曲線

圖2 白及多糖對卵巢癌細(xì)胞抑制率曲線

4.2 白及多糖對3種腫瘤細(xì)胞周期分布的影響 流式細(xì)胞檢測顯示白及多糖培養(yǎng)sgc后，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞無明顯變化，G2/M期細(xì)胞減少;白及多糖培養(yǎng)A2780后，S期細(xì)胞增多，G2/M期細(xì)胞減少，G0/G1期細(xì)胞無明顯變化;白及多糖培養(yǎng)HepG2后，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞無明顯變化，G2/M期細(xì)胞減少 (見表1)。由此可知，白及多糖將sgc細(xì)胞和HepG2細(xì)胞阻滯在G0/G1期，將A2780細(xì)胞阻滯在S期。

圖3 白及多糖對肝癌細(xì)胞抑制率曲線

表1 白及多糖對3種腫瘤細(xì)胞周期分布的影響

5 討論

多糖是自然界普遍存在的一類生物大分子，具有廣泛的生物學(xué)活性，作為免疫調(diào)節(jié)劑可激活多種免疫細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子生成，活化補(bǔ)體而發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等作用［5］。目前研究認(rèn)為多糖抗腫瘤作用:一是對腫瘤細(xì)胞的直接作用，即多糖直接殺死腫瘤細(xì)胞，包括對腫瘤細(xì)胞膜的特異性作用、抗自由基作用、誘導(dǎo)分化與誘導(dǎo)凋亡、對腫瘤基因的改變及對腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響等［6］;二是作為免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能而間接抑制或者殺滅腫瘤細(xì)胞［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白及多糖在體外對3種腫瘤細(xì)胞的生長均有抑制作用，且抑制效應(yīng)隨白及多糖質(zhì)量濃度的不同而明顯不同 (P＜0.05)，說明白及多糖具有抑制sgc、A2780和Hep-G2增殖的作用，并且，IC50值提示對sgc的抑制作用最明顯。

以往的研究表明多糖抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果與劑量雖然存在依賴關(guān)系，但這種關(guān)系并不十分嚴(yán)格［8］。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度過高時(shí)，多糖對腫瘤細(xì)胞的抑制增殖作用反而有所減弱［9］。出現(xiàn)這種現(xiàn)象，可能與多糖是混合多糖的特征有關(guān)［10］。多糖成分復(fù)雜，可能也是造成對多糖抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果和機(jī)理研究結(jié)果難于統(tǒng)一的原因之一，這無疑也是將多糖真正用于腫瘤臨床治療的障礙之一［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著白及多糖質(zhì)量濃度的逐漸增加，對3種腫瘤細(xì)胞的抑制率也逐漸上升，但增加到最高質(zhì)量濃度后反而抑制率有所下降。提高多糖的純化率可能是有效的實(shí)現(xiàn)多糖真正發(fā)揮抑制腫瘤增殖作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其必將依賴多糖提取與純化技術(shù)的進(jìn)一步提高。

在本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，經(jīng)白及多糖處理后，3種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期均發(fā)生了停滯，sgc細(xì)胞和HepG2細(xì)胞停滯在G0/G1期，A2780細(xì)胞停滯在S期。細(xì)胞周期在腫瘤的生長調(diào)控中具有非常重要的作用，細(xì)胞周期有G1期關(guān)鍵點(diǎn)和G2期關(guān)鍵點(diǎn)，G1期檢驗(yàn)點(diǎn)決定細(xì)胞能否通過G1期進(jìn)入S期，它是細(xì)胞周期的始動(dòng)機(jī)制;G2期向M期的轉(zhuǎn)變涉及到細(xì)胞的有絲分裂，包括胞質(zhì)分裂和核DNA分裂，完成由1個(gè)細(xì)胞向2個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［12-14］。許多抗腫瘤藥對腫瘤細(xì)胞的分裂周期具有選擇性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)白及多糖處理后，3種腫瘤細(xì)胞于不同的細(xì)胞周期發(fā)生增殖抑制，可能與此有關(guān)。細(xì)胞凋亡又稱為細(xì)胞程序性死亡［15］，目前認(rèn)為，許多腫瘤的發(fā)生就是由于該腫瘤細(xì)胞凋亡通道受阻而引起的。白及多糖對腫瘤細(xì)胞周期的阻滯作用，為其具有抗腫瘤作用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，也為以后更進(jìn)一步地進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn)提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但是白及多糖具體通過哪些通道而發(fā)生抗腫瘤作用，是否通過凋亡途徑，仍然是今后進(jìn)一步研究的課題。

天然多糖臨床不良反應(yīng)小，目前不少多糖已應(yīng)用于臨床治療，在多個(gè)領(lǐng)域內(nèi)顯示出良好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)所用的白及多糖是經(jīng)過層析柱分離純化的多糖組分，而非單糖結(jié)構(gòu)，因此其顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用很可能是多種單糖聚合在一起的協(xié)同作用。白及多糖可抑制腫瘤細(xì)胞的生長，影響腫瘤細(xì)胞的生長周期，但是否與多糖誘發(fā)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞間信號分子表達(dá)、改變腫瘤基因等因素有關(guān)，值得進(jìn)一步深入研究。

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