高 霞，陳 彥*，王 瑩，周 靜

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210023;2.江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥新型給藥系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局中藥口服制劑釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，江蘇南京 210028)

淫羊藿是傳統(tǒng)的補(bǔ)腎中藥，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用［1］。淫羊藿中黃酮成分是主要活性成分，主要有淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C等黃酮苷類［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明淫羊藿總黃酮具有很好的抗骨質(zhì)疏松等作用［3-5］，但口服需經(jīng)過腸道內(nèi)酶和菌的酶解作用轉(zhuǎn)化成為次級苷才能夠很好地吸收發(fā)揮作用［6］。由于人體腸道內(nèi)存在的水解酶 (腸道黏膜酶和腸道菌酶)因人種、年齡、飲食、藥物的影響而不同［7-9］，因此難以保證口服淫羊藿黃酮后能穩(wěn)定快速的被水解吸收，并保持較好的抗骨質(zhì)疏松等藥效。基于淫羊藿黃酮苷腸道酶解特點(diǎn)，課題組形成了構(gòu)建外加水解酶、藥物、功能輔料三位一體的適宜于淫羊藿總黃酮腸道內(nèi)“實(shí)時(shí)酶解”、“實(shí)時(shí)吸收”的仿生酶解口服給藥系統(tǒng)的研究思路。課題組在前期成功地在體外用蝸牛酶酶解淫羊藿總黃酮模擬其體內(nèi)過程，本實(shí)驗(yàn)將探討制劑成型過程中的制粒因素對淫羊藿總黃酮酶解可能產(chǎn)生的影響，為淫羊藿總黃酮仿生酶解口服給藥系統(tǒng)構(gòu)建的可行性積累實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀 (DAD檢測器，四元泵，美國Agilent公司);數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器 (金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠);METTLER AL204十萬分之一天平 (瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);離心機(jī) (長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)。

淫羊藿 (購自吉林敦化，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳德康教授鑒定為朝鮮淫羊藿);蝸牛酶 (上海源葉生物科技有限公司);淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶藿苷Ⅰ對照品 (上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%)，淫羊藿苷元對照品 (自制，純度﹥98%);糊精 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號F20100816);乙腈為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿總黃酮提取物的制備 稱取淫羊藿300 g，加15倍量50% 乙醇回流提取兩次，每次2 h，合并兩次濾液，回收乙醇［10］，真空干燥，得含4.44 g生藥/g的淫羊藿總黃酮粉末。

2.2 含酶淫羊藿總黃酮顆粒的制備 取蝸牛酶125 mg和糊精3 g混勻，再加入淫羊藿總黃酮粉末675 mg，混勻，加適量水制軟材，過20目篩制粒，低溫干燥，得含酶淫羊藿總黃酮顆粒。

2.3 淫羊藿總黃酮的體外酶解 取淫羊藿總黃酮粉末27 mg，加入10 mL pH 6.0的HBSS平衡鹽溶液中，放入37℃ 恒溫振蕩器中保溫。取蝸牛酶5 mg，用10 mL的pH 6.0的HBSS平衡鹽溶液溶解。將酶液加至等量的淫羊藿提取物溶液中，在37℃恒溫振蕩器中反應(yīng)。另稱取含酶淫羊藿總黃酮顆粒152 mg，置于錐形瓶中，加入pH 6.0的HBSS緩沖溶液20 mL，放入37℃恒溫振蕩器中反應(yīng)，分別在0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6 h時(shí)取上述兩種反應(yīng)液各150 μL，立即加300 μL乙醇終止反應(yīng)，渦旋，離心后進(jìn)HPLC儀分析測定，比較淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及其酶解產(chǎn)物寶藿苷Ⅰ、箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ和淫羊藿苷元的量變化。實(shí)驗(yàn)平行3次。

2.4 HPLC測定酶解液中6種主要黃酮成分的分析方法的建立

2.4.1 色譜條件 Zorbax SB C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈-水，梯度洗脫 (0～15 min，10% ～25% 乙腈;15～38 min，25% 乙腈;38～61 min，25% ～71% 乙腈;61～75 min，71% ～100% 乙腈);檢測波長270 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃。色譜圖見圖1。

圖1 對照品 (A)、酶解前樣品 (B)和酶解后樣品 (C)的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，unenzymolysis sample(B)and enzymolysis sample(C)

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷5.33 mg，朝藿定A 8.42 mg，朝藿定 B 9.05 mg，朝藿定C 8.26 mg，寶藿苷Ⅰ5.26 mg，淫羊藿苷元7.50 mg，加無水乙醇溶解稀釋至10 mL，作為貯備液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取轉(zhuǎn)化后的混懸液適量，立即加無水乙醇終止反應(yīng)，渦旋，離心后即得。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元貯備液適量，加無水乙醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。所含朝藿定A分別為2.6、5.3、10.5、21.0、42.1、84.2、168.4 μg/mL，所含朝藿 定 B 分 別 為 1.4、2.8、5.7、11.3、22.6、45.2、90.5、181.0 μg/mL，所含朝藿定C分別為2.6、 5.2、 10.3、 20.6、 41.2、 82.6、 165.2 μg/mL，所含淫羊藿苷分別為 1.7、3.3、6.7、13.3、26.6、53.3、106.6 μg/mL，所含寶藿苷Ⅰ分 別 為 3.3、6.6、13.2、26.3、52.6、105.2 μg/mL，所含淫羊藿苷元分別為4.7、9.4、18.8、37.5、75.0、150.0 μg/mL。分別精密吸取各對照品溶液10 μL，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度 (x，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積 (y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得6種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。朝藿定A的線性回歸方程為y=17.443x+23.584，r=0.999;朝藿定B的線性回歸方程為y=27.196 x+21.610，r=0.999;朝藿定C的線性回歸方程為y=18.415x+19.589，r=1.000;淫羊藿苷的線性回歸方程為y=30.459x+24.061，r=0.999;寶藿苷Ⅰ的線性回歸方程為y=24.718x+23.400，r=0.999;淫羊藿苷元的線性回歸方程為y=6.895x－37.550，r=0.999。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明朝藿定A在0.026～1.684 μg，朝藿定B在0.014～1.810 μg，朝藿定C在0.026～1.652 μg，淫羊藿苷在 0.017～1.066 μg，寶藿苷Ⅰ在0.033～1.052 μg，淫羊藿苷元在 0.0470 ～1.500 μg都呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述各對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣 6次，測定峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的RSD值分別是0.4%、1.0%、0.1%、0.8%、1.0%、1.5%。表明儀器的精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述供試品溶液，室溫放置，分別于 0、1、2、4、8、12和 24 h進(jìn)樣10 μL，測定各成分的峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的RSD值分別是0.6%、1.4%、0.3%、0.8%、1.2%、1.8%。表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，測定各成分的峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的RSD值分別是0.6%、1.7%、0.2%、1.1%、1.5%、2.0%。表明樣品的重復(fù)性較好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元質(zhì)量濃度的供試品溶液6份，分別加入一定量的對照品，用無水乙醇稀釋至一定濃度并進(jìn)樣10 μL，計(jì)算各對照品的平均加樣回收率和RSD值。結(jié)果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的平均回收率分別為100.0%、99.5%、99.6%、100.2%、99.6%、98.9%;RSD值分別為 0.6%、1.1%、1.2%、1.1%、1.3%、1.4%。

2.5 酶解結(jié)果比較

2.5.1 含酶淫羊藿總黃酮顆粒與未制粒的淫羊藿總黃酮中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的酶解數(shù)據(jù)見圖2。淫羊藿總黃酮粉末與蝸牛酶不經(jīng)制粒直接反應(yīng)時(shí)，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C都在1 h左右基本酶解完全。經(jīng)糊精濕法制粒得到的含酶淫羊藿總黃酮顆粒酶解時(shí)，淫羊藿苷、朝藿定A和朝藿定C在2 h時(shí)基本酶解完全，朝藿定B在3 h基本酶解完全，且三者的初始濃度都略低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)糊精濕法制粒后淫羊藿總黃酮酶解的速率變慢，這是由于淫羊藿總黃酮與蝸牛酶首先需要從顆粒中釋放才能反應(yīng)，但在3 h內(nèi)都能基本溶出并酶解，而人體腸道排空時(shí)間為4～6 h，因此糊精濕法制粒對含酶淫羊藿總黃酮顆粒中原型黃酮苷的消除影響不大。

圖2 糊精濕法制粒對淫羊藿苷與朝藿定A、B、C酶解的影響 (n=3)Fig.2 Enzymolysis changes of icariin，epimedin A，epimedin B ，and epimedin C by dextrin wet granulation(n=3)

2.5.2 淫羊藿總黃酮中淫羊藿苷的酶解產(chǎn)物寶藿苷Ⅰ及終產(chǎn)物淫羊藿苷元質(zhì)量濃度的變化可知，寶藿苷Ⅰ是淫羊藿苷水解掉C 7位上的葡萄糖生成的次級苷［11］。酶解液中寶藿苷Ⅰ的質(zhì)量濃度由兩方面決定，一方面淫羊藿苷水解生成寶藿苷Ⅰ，另一方面寶藿苷Ⅰ酶解成淫羊藿苷元。淫羊藿總黃酮粉末與蝸牛酶不經(jīng)制粒直接反應(yīng)時(shí)，寶藿苷Ⅰ的質(zhì)量濃度在1 h時(shí)達(dá)到最高值21.87 μg/mL，之后質(zhì)量濃度逐漸下降，說明它被繼續(xù)水解成了苷元，6 h時(shí)其質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定，此時(shí)寶藿苷Ⅰ的質(zhì)量濃度僅有1.81 μg/mL，轉(zhuǎn)化了83.08%。含酶淫羊藿總黃酮顆粒酶解時(shí)，寶藿苷Ⅰ的質(zhì)量濃度在3 h時(shí)達(dá)到最高值 24.35 μg/mL，之后質(zhì)量濃度逐漸下降，6 h時(shí)寶藿苷Ⅰ的質(zhì)量濃度為6.75 μg/mL，轉(zhuǎn)化了69.55%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)糊精濕法制粒后酶解產(chǎn)物寶藿苷Ⅰ的生成速率基本不變，但是水解速率顯著變慢，6 h時(shí)寶藿苷Ⅰ的質(zhì)量濃度是未制粒淫羊藿總黃酮酶解時(shí)的3.7倍。因此，糊精濕法制?？梢蕴岣呙附庖褐袑氜杰闸竦牧俊?/p>

淫羊藿苷元是淫羊藿總黃酮水解掉所連接的糖基 (主要是C 3和C 7位上的糖)得到的終產(chǎn)物。淫羊藿總黃酮粉末與蝸牛酶不經(jīng)制粒直接反應(yīng)時(shí)，淫羊藿苷元的量隨酶解時(shí)間不斷增加，0～4 h基本成線性增加，生成速率約為8.12 μg/(mL·h)，6 h時(shí)淫羊藿苷元的質(zhì)量濃度為30.35 μg/mL。含酶淫羊藿總黃酮顆粒酶解時(shí)，淫羊藿苷元的量隨酶解時(shí)間亦不斷增加，0～6 h基本成線性增加，生成速率約為3.43 μg/(mL·h)，6 h時(shí)淫羊藿苷元的質(zhì)量濃度為19.43 μg/mL。與未制粒時(shí)相比較，其生成速率提高了2.4倍，6 h時(shí)的量提高了1.6倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)糊精濕法制粒后酶解產(chǎn)物淫羊藿苷元的生成速率顯著變慢，酶解液中的質(zhì)量濃度也較低。因此，糊精濕法制粒不利于淫羊藿苷元的生成，見圖3。

2.5.3 淫羊藿總黃酮中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的酶解產(chǎn)物箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量的變化見圖4。箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、寶藿苷Ⅰ分別是朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C水解掉C 7位上的葡萄糖生成的次級苷［11］。箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的單體成分較難獲得，因此以峰面積的大小來比較上述3種酶解產(chǎn)物在酶解過程中的變化。淫羊藿總黃酮粉末與蝸牛酶不經(jīng)制粒直接反應(yīng)時(shí)，箭藿苷A、箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量在1 h左右達(dá)到最高，之后含有量逐漸下降，說明它們被繼續(xù)水解為其他物質(zhì)，于6 h時(shí)箭藿苷A轉(zhuǎn)化了21.30%，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ轉(zhuǎn)化了18.87%，而箭藿苷B基本不再水解。含酶淫羊藿總黃酮顆粒酶解時(shí)，箭藿苷A、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量在2 h左右達(dá)到最高，箭藿苷B在3 h左右達(dá)到最高，且三者最終趨于穩(wěn)定的量比未制粒淫羊藿總黃酮酶解時(shí)的都略高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)糊精濕法制粒后箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的生成速率略微變慢，但最終趨于穩(wěn)定的量都略高。因此糊精濕法制粒有利于提高酶解液中次級苷箭藿苷A、箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量。

圖3 糊精濕法制粒對酶解產(chǎn)物寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的影響 (n=3)Fig.3 Content changes of baohuosideⅠand icaritin by dextrin wet granulation(n=3)

圖4 糊精濕法制粒對酶解產(chǎn)物箭藿苷A、B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的影響 (n=3)Fig.4 Content changes of sagittatoside A，sagittatoside B，and 2″-O-rhamnosylicariside Ⅱby dextrin wet granulation(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)將蝸牛酶、淫羊藿總黃酮和糊精混合后制成含酶淫羊藿總黃酮顆粒，考查糊精濕法制粒對蝸牛酶仿生酶解淫羊藿總黃酮的影響。為模擬體內(nèi)腸道情況，酶解溫度選擇了37℃，緩沖液選擇了pH 6.0的HBSS平衡鹽溶液。因?yàn)槭澄锱c藥物一般在人體腸道停留的時(shí)間為4～6 h［12］，所以僅考查了6 h內(nèi)淫羊藿總黃酮的轉(zhuǎn)化情況。蝸牛酶與淫羊藿總黃酮經(jīng)糊精濕法制粒后酶解，淫羊藿總黃酮中主要原型黃酮成分在3 h內(nèi)都能完全被酶解，雖酶解速率變慢，但在腸道排空時(shí)間內(nèi)都能溶出并被完全酶解;酶解產(chǎn)物的生成速率也變慢，但是6 h時(shí)酶解液中次級苷寶藿苷Ⅰ、箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的量都相對略高，但淫羊藿苷元的量相對較低，僅有未制粒直接酶解時(shí)的64.02%。所以糊精濕法制粒對淫羊藿總黃酮的酶解轉(zhuǎn)化有一定影響。

本實(shí)驗(yàn)只是用糊精作為輔料簡單制粒，探索淫羊藿黃酮仿生酶解口服給藥系統(tǒng)構(gòu)建的可行性，今后還可以采用多種功能輔料優(yōu)化制劑成型過程，促進(jìn)酶解，以提高制劑的生物利用度。此外，由于含酶淫羊藿總黃酮顆粒的酶解行為與未制粒粉末比較有一定差別，其藥效是否會有差別還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)考查。

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