孫穩(wěn)，丁國(guó)富，王勤章

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,石河子832000；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，石河子 832000）

泌尿系結(jié)石是最常見(jiàn)的泌尿外科疾病之一，由多因素共同作用所致，其病理機(jī)制目前尚不明確。研究表明：尿鈣排泄增高是誘發(fā)或促進(jìn)含鈣尿路結(jié)石的形成的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素[1]。Claudin-14為緊密連接蛋白家族的一員，在正常腎臟中不表達(dá)，只有在異常情況下才表達(dá)，且嚴(yán)格定位于腎臟的髓袢升支粗段（thick ascending limb，TAL）[2]，可通過(guò)降低細(xì)胞旁途徑的緊密連接蛋白-16和緊密連接蛋白-19構(gòu)成的陽(yáng)離子通道滲透性抑制腎小管對(duì)鈣的被動(dòng)重吸收[3-5]，從而促進(jìn)尿鈣排泄。全基因組關(guān)聯(lián)性研究也顯示[6]：Claudin-14基因與高鈣尿腎結(jié)石的發(fā)生顯著相關(guān)。

由此我們推測(cè)，在結(jié)石腎組織中Claudin-14可能通過(guò)促進(jìn)尿鈣排泄參與結(jié)石的形成。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)構(gòu)建大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型初步探討Claudin-14在腎草酸鈣結(jié)石大鼠腎組織中的表達(dá)變化及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1主要試劑和儀器

乙二醇（Sigma，美國(guó)），氯化銨（Sigma，美國(guó)），兔抗 Claudin-14抗體（Santa Cruz，美國(guó)），山羊抗兔二抗lgG（北京中山金橋，中國(guó)）。

Au1000自動(dòng)生化分析儀 （Olympus，日本），180-80型原子吸收分光光度計(jì)（Hitachi Limited，日本），PCR 儀（TaKaRa，日本），mini垂直電泳槽，半干式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Bio-rad公司，美國(guó)）。

1.1.2實(shí)驗(yàn)分組和大鼠腎結(jié)石模型的構(gòu)建

參照曹正國(guó)等[7]的方法制作大鼠腎結(jié)石模型。選用8周齡S-D雄性大鼠30只 （購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），SPF 級(jí)，體重（200±20）g。

將大鼠隨機(jī)分為2組（n=15），對(duì)照組：自來(lái)水飲水，每日每只2 mL生理鹽水灌胃；結(jié)石組（n=15）：含1%乙二醇自來(lái)水自由飲水，每日每只2 mL 2%氯化銨灌胃。實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，連續(xù)灌胃4周。

1.2 方法

1.2.1大鼠24 h尿鈣含量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)第28天收集實(shí)驗(yàn)大鼠24 h尿液，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行24 h尿鈣含量測(cè)定。

1.2.2腎組織HE染色

連續(xù)灌胃4周后水合氯醛麻醉處死實(shí)驗(yàn)大鼠，手術(shù)切取左腎，福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后切片行常規(guī)HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察腎組織形態(tài)學(xué)變化及腎小管區(qū)有無(wú)結(jié)石結(jié)晶，以判斷腎結(jié)石模型是否成功建立。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)腎臟組織中的Claudin-14 mRNA的表達(dá)

按Trizol法提取腎組織總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA A260/A280均為1.8-2.0，用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳確定RNA純度。

將Trizol試劑提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行Claudin-14和GAPDH基因的PCR檢測(cè)。

Claudin-14 上 游引物 序列：5’-GACGAGGTGACTTCTCTGGC-3’；

下 游 引 物 序 列 ：5’ -ACACACCCTCTAGTGCAGGC-3’。

產(chǎn)物大小為242 bp，反應(yīng)條件為：95℃5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共 35 個(gè)循環(huán)，72℃10 min。

GAPDH 上游引物：5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’；

下 游 引 物 ：5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。

產(chǎn)物大小為496 bp，反應(yīng)條件為：95℃5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 35 個(gè)循環(huán)，72℃10 min，取4 μL PCR產(chǎn)物加1 μL的溴芬藍(lán)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察，并用Bio-rad凝膠成像分析系統(tǒng)分別計(jì)算Claudin-14 mRNA和GAPDH mRNA的積分光密度值。

1.2.4 Western-Blotting法檢測(cè)腎臟組織Claudin-14蛋白的表達(dá)

取100 mg腎臟組織低溫研磨后，加入PMSF及蛋白裂解液 （1∶100）， 冰上放置 40 min，4 ℃下13300 r/min離心40 min后取上清。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法對(duì)上清進(jìn)行蛋白定量。

取 40 μg蛋白樣品，10%SDS-PAGE 電泳，半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，37℃封閉液中封閉 2 h；Claudin-14 抗體 （1∶500），4℃下孵育 12 h。 次日用TBST洗膜 20 min×3次， 加入相應(yīng)的二抗 （1∶20000）， 室溫下孵育2 h，TBST洗膜20 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，顯影定影處理，獲取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Quantity one軟件分析圖像。

實(shí)驗(yàn)以β-actin蛋白條帶為內(nèi)參照，結(jié)果用靶蛋白/β-actin的比值表示。

實(shí)驗(yàn)采用TBS-T液代替Claudin-14抗體孵育作為陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Sigmstat 3.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（S）表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson Correlation，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 24 h尿鈣排泄量

兩組比較，結(jié)石組24 h尿鈣排泄量顯著高于對(duì)照組，分別為：（9.66±1.10）和（3.26±0.60）mmol，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)果

肉眼可見(jiàn)結(jié)石組大鼠腎組織腫脹，表面點(diǎn)狀分布黃白色結(jié)晶或鈣化（圖1）。

圖1 大鼠腎臟外觀(guān)變化Fig.1 Appearance change of the kidney in rats

HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)結(jié)石組大鼠腎組織多數(shù)腎小管管腔內(nèi)彌漫散布無(wú)色透明、片狀結(jié)晶，皮質(zhì)多于髓質(zhì)，主要位于近曲小管和遠(yuǎn)曲小管。腎小管上皮細(xì)胞明顯腫脹、變性、壞死，管腔內(nèi)可見(jiàn)嗜伊紅樣壞死物質(zhì)及部分脫落上皮細(xì)胞，腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞侵潤(rùn)（圖2B）。對(duì)照組無(wú)上述病理改變（圖2A）。

圖2 大鼠腎組織光鏡下觀(guān)察（HE×200）Fig.2 The rats renal tissue were observed under light(HE×200)

2.3 RT-PCR檢測(cè)腎組織Claudin-14 mRNA結(jié)果

結(jié)石組Claudin-14 mRNA顯著高于對(duì)照組，凝膠成像系統(tǒng)掃描灰度值顯示Claudin-14 mRNA相對(duì)表達(dá)含量在對(duì)照組和結(jié)石組中分別為0.039±0.007和0.128±0.006，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）（圖 3）。

圖3 大鼠腎組織Claudin-14mRNA/GAPDH電泳結(jié)果分析Fig.3 The result analysis of Claudin-14 mRNA/GAPDH in rat kidney tissue

2.4 Western-Blotting檢測(cè)腎組織Claudin-14蛋白結(jié)果

結(jié)石組Claudin-14蛋白與對(duì)照組相比顯著增高，對(duì)照組未見(jiàn)表達(dá)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖 4）。

圖4 2組大鼠腎組織Claudin-14蛋白Western-Blotting檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Expression of Claudin-14/β-actin in rat kidney tissue by Western-Blotting

2.5 Claudin-14蛋白表達(dá)與24h尿鈣排泄相關(guān)性分析

結(jié)石組大鼠腎組織中Claudin-14蛋白相對(duì)表達(dá)量與24 h尿鈣呈正相關(guān)，r=0.747，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），因?qū)φ战M未見(jiàn)Claudin-14蛋白表達(dá)，故未做相關(guān)性分析。

3 討論

泌尿系結(jié)石的發(fā)生由多因素共同作用所致。有研究顯示：高鈣尿癥與含鈣結(jié)石的發(fā)生顯著相關(guān)[8]。眾所周知，尿鈣水平取決于腎小球?qū)︹}的濾過(guò)與腎小管對(duì)鈣的重吸收，腎小管對(duì)鈣的重吸收包括主動(dòng)重吸收和被動(dòng)重吸收，被動(dòng)重吸收的鈣量約占總重吸收鈣量的85%，主要通過(guò)近曲小管和髓袢升支粗段（TAL）的細(xì)胞旁途徑進(jìn)行[9]，這間接說(shuō)明細(xì)胞旁途徑在尿鈣排泄過(guò)程中扮演著重要角色。

緊密連接主要存在于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間的連接復(fù)合體中，可使相鄰細(xì)胞膜緊靠在一起，形成圍繞細(xì)胞的物理屏障結(jié)構(gòu)，具有封閉上皮細(xì)胞間隙，防止可溶性物質(zhì)從細(xì)胞一側(cè)擴(kuò)散到另一側(cè)的屏障功能，同時(shí)把上皮細(xì)胞分成頂端的脂質(zhì)成分和基質(zhì)的蛋白質(zhì)成分兩個(gè)不同的功能區(qū)[10]。Claudin-14作為緊密連接蛋白家族的一員，是構(gòu)成TAL細(xì)胞旁途徑的的重要組成蛋白[3-5]。Elkouby-Naor L等[11]研究顯示在給予Claudin-11/Claudin-14雙基因敲除小鼠高鈣飲食時(shí)，小鼠出現(xiàn)了高鎂血癥、低鎂尿癥，尿鈣沒(méi)有出現(xiàn)增高反而出現(xiàn)了降低，這提示Claudin-14可能在腎臟鈣離子的排泄過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR及Western-Blotting從不同層面首次證實(shí)：在結(jié)石組大鼠腎組織中claudin-14存在表達(dá)，且結(jié)石組claudin-14表達(dá)顯著高于對(duì)照組。通過(guò)對(duì)兩組大鼠24 h尿鈣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：結(jié)石組尿鈣排泄顯著高于對(duì)照組，且尿鈣排泄量與claudin-14蛋白表達(dá)量存在正相關(guān)。由此，我們推測(cè)：claudin-14參與腎結(jié)石形成可能是通過(guò)增加尿鈣排泄發(fā)揮重要作用，其可能機(jī)制：claudin-14高表達(dá)下調(diào)細(xì)胞旁途徑的緊密連接蛋白-16(Claudin-16)和緊密連接蛋白-19(Claudin-19)構(gòu)成的雜聚肽陽(yáng)離子通道滲透率抑制腎小管對(duì)鈣的重吸收[3-5]，從而參與高尿鈣性腎結(jié)石的形成。

我們的實(shí)驗(yàn)同時(shí)也發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象，Claudin-14 mRNA在對(duì)照組和結(jié)石組腎組織均有表達(dá)，且結(jié)石組上調(diào)顯著高于對(duì)照組，相反，Claudin-14蛋白在結(jié)石組顯著增高，而在對(duì)照組卻幾乎檢測(cè)不到，故我們推測(cè)在體內(nèi)Claudin-14可能受某種影響因素調(diào)控。有研究顯示[12]：正常鈣或低鈣飲食時(shí)，Claudin-14轉(zhuǎn)錄和翻譯水平被兩個(gè)microRNAs抑制 （miR-9和 miR-374）， 這兩個(gè)microRNAs以協(xié)同的方式直接作用于Claudin-14 mRNA的3，-UTR，促使Claudin-14 mRNA衰退，進(jìn)而抑制其翻譯成蛋白；當(dāng)給予一個(gè)高鈣飲食時(shí)，Claudin-14轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著增高，研究中也發(fā)現(xiàn)低鈣飲食時(shí)，miR-9和miR-374顯著上調(diào)，而在高鈣飲食時(shí)，miR-9和miR-374顯著下調(diào)。相似的研究也顯示[13]：在通過(guò)給予MKTAL細(xì)胞高鈣時(shí)（3 mM Ca2+），這兩個(gè)microRNAs被最大限度的抑制，Claudin-14 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國(guó)外研究結(jié)果相符。即TAL可能確實(shí)存在一種可調(diào)控Claudin-14 mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯的microRNAs，同時(shí)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)microRNAs可能受細(xì)胞外鈣敏感受體（CaSR）調(diào)節(jié)，CaSR作為一種G蛋白偶聯(lián)受體在鈣穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用[14-15]，在腎臟中有調(diào)節(jié)尿鈣排泄的作用[16]。由此，我們推測(cè)：Claudin-14表達(dá)增高促進(jìn)尿鈣排泄可能受CaSR-microRNAs通路調(diào)控，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制還有待下一步研究。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果有利于充實(shí)對(duì)高尿鈣性含鈣腎結(jié)石的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為泌尿系結(jié)石預(yù)防和治療的相關(guān)研究提供新的思路和靶點(diǎn)。

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