祖克拉·肉孜，吐?tīng)栠d·買買提，宋曼殳，多力坤·買買提玉素甫?

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046；2.新疆阿克蘇職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，新疆阿克蘇843000；3.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京100069)

腎素-血管緊張素（renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS）系統(tǒng)可通過(guò)不同機(jī)制參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生.自1990年Hubert[1]發(fā)現(xiàn)人ACE基因16內(nèi)含子存在插入(I)/缺失(D)多態(tài)性，ACE基因多態(tài)性與各種疾病的關(guān)系受到廣泛關(guān)注，針對(duì)不同民族人群的研究結(jié)論不盡相同[2,3].不同人種的生活環(huán)境及進(jìn)化過(guò)程存在的差異，直接影響了易感基因的頻率、連鎖不平衡的情況及其在特定人群中作用的大小，因而在不同人群中進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，有望揭示該人群真正的致病位點(diǎn).回顧我國(guó)近年來(lái)有關(guān)ACE基因多態(tài)性與2型糖尿病關(guān)聯(lián)研究，以經(jīng)濟(jì)較為發(fā)達(dá)的東南沿海地區(qū)的漢族人群為主[4,5].新疆地區(qū)ACE基因多態(tài)性及其與高血壓、冠心病的關(guān)系已有報(bào)道[6,7]，但未見(jiàn)其與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究.本研究探討ACE基因I/D多態(tài)性在南疆地區(qū)2個(gè)少數(shù)民族人群中的分布情況及其與T2DM遺傳易感性的關(guān)系.

糖調(diào)節(jié)受損是最重要的2型糖尿病高危人群，1995～1997年調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)IGT(impaired glucose tolerance,IGT)標(biāo)化患病率為4.76%，約為糖尿病標(biāo)化患病率的1.5倍[8]，每年有1.5%～10%的IGT患者進(jìn)展為2型糖尿病[9].2型糖尿病的病理過(guò)程各階段間尚無(wú)明確的分界標(biāo)志，IGT是公認(rèn)的T2DM前期病變，5～10年后約25%～48%發(fā)展為臨床糖尿病，可近似認(rèn)為兩者是同一疾病的不同發(fā)展階段，具有同質(zhì)性.較低水平表型涉及的基因或變異相對(duì)少，適當(dāng)應(yīng)用中間表型如空腹血糖水平、空腹胰島素水平，理論上可以增加發(fā)現(xiàn)疾病易感基因的機(jī)會(huì)[10,11].目前的關(guān)聯(lián)研究多以2型糖尿病患者與血糖正常人群為研究對(duì)象，鮮有IGT人群.本研究除2型糖尿病患者與正常血糖人群外，同時(shí)納入了糖耐量減低人群.

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究于2012年7月～2013年8月分別自和田民豐縣人民醫(yī)院和阿圖什哈拉峻鄉(xiāng)人民醫(yī)院采集無(wú)血緣關(guān)系、年齡性別匹配的維吾爾族127例、柯?tīng)柨俗巫?17例樣本.按照1999年WHO公布的糖尿病新診斷標(biāo)準(zhǔn)（①糖尿病癥狀，②空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)≥7.0 mmol/L或③餐后2h血糖≥11.1mmol/L或③隨機(jī)血糖≥11.1mmol/；無(wú)糖尿病癥狀者，需另日復(fù)查血糖）及糖代謝分類（正常血糖：餐后2h血糖＜7.8mmol/L；糖耐量減低(impaired glucose tolerance,IGT)：餐后2h血糖7.8～11.1mmol/L）將研究對(duì)象分為正常糖耐量組(normal glucose tolerance,NGT)、糖耐量減低組及2型糖尿病組.通過(guò)臨床特征及家族史排除青年發(fā)病的成年型糖尿病、母系遺傳的糖尿病及妊娠性糖尿病、線粒體糖尿病、1型糖尿病、高血壓、冠心病等其它明顯器質(zhì)性疾病.

要求所有調(diào)查對(duì)象均在所在地區(qū)居住三代以上，無(wú)血緣關(guān)系，年齡>20歲，家庭婚姻史為世代族內(nèi)通婚.自肘靜脈采血3mL加0.5mLACD抗凝，充分混勻后放入-20?冰箱冷藏室保存待檢.

按統(tǒng)一調(diào)查表進(jìn)行直接問(wèn)卷調(diào)查.對(duì)調(diào)查對(duì)象進(jìn)行詳細(xì)詢問(wèn)按項(xiàng)目?jī)?nèi)容逐項(xiàng)填寫(xiě)，力求調(diào)查表完整不缺項(xiàng)：電話、年齡、性別、身高、體重、腰圍、臀圍、血壓、心率、吸煙史、飲酒史、家族史等.上述調(diào)查和取樣均征得受試者本人同意并簽署知情同意書(shū).

1.2 主要試劑和儀器

PCR引物由上海生工公司合成，引物C1序列為5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’，引物B1序列為5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’.DNA Ladder購(gòu)于寶生物工程大連有限公司，100mmol/L dNTPs(含Mg2+)、2U/μL Taq DNA聚合酶均購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司.所用試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.基因擴(kuò)增儀（美國(guó)），電泳儀和M-15E紫外圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)），高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)）.

1.3 基因組DNA的提取

取冷藏保存的抗凝全血0.5mL注入1.5mL離心管P中，加雙蒸水震蕩使紅細(xì)胞破裂，15 000r/min，留取白色沉淀，用酚-氯仿-異戊醇法提取DNA：取50μL WBC加入600μL TES充分顛倒混勻；37?C水浴過(guò)夜；加入等體積酚(700μL)，顛倒混勻2 min，10 000r/min，離心5 min,取上清液；重復(fù)上述步驟.加入等體積氯仿-異戊醇(24:1)，顛倒混勻2 min后，10 000 r/min,離心5 min，取上清液.再加入2倍體積的冷無(wú)水乙醇(-20?C冰箱中儲(chǔ)存的)顛倒混勻，置-20?C冰箱沉淀30 min以上.12 000r/min，離心20 min(4?C)，棄上清.加入750mL/L乙醚1mL小心洗滌沉淀（顛倒混勻），12 000 r/min，離心10 min(4?C)，棄上清.靜置10～20 min，待管壁殘留的乙醇揮發(fā)干凈后，將沉淀溶于50μL去離子水中即得DNA溶液，-20?C保存?zhèn)溆?

1.4 ACE D/I基因多態(tài)性檢測(cè)

1.4.1 PCR擴(kuò)增

25μL的PCR反應(yīng)體系中含有100 ng基因組DNA、10×PCR buffer為2.5μL,4×dNTP(10 mmol/L)為2.5μL,MgCI2(25 mmol/L)為1.5μL,引物C1和B1各10 pmol/L，1 U Taq DNA聚合酶,加去離子水補(bǔ)至終體積25μL.PCR擴(kuò)增條件為94?C 5 min 預(yù)變性，循環(huán)次數(shù)為35個(gè)（94?C 1 min 變性，56?C 1 min 退火，72?C 1 min 延伸），72?C 10 min最后延伸，4?C保存.

1.4.2 基因分型

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL，2%瓊脂糖凝膠電泳，100V，30 min，溴乙錠(EB)染色后，用UVI凝膠成像分析儀記錄結(jié)果.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

首先運(yùn)用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算兩組基因型和等位基因頻率，運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確認(rèn)樣本的群體代表性(檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P=0.05).組間等位基因頻率和基因型頻率比較采用卡方檢驗(yàn).三組間計(jì)量資料的比較采用方差分析法，全部數(shù)據(jù)采用SPSSl7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.采用Logistic回歸分析，用比值比（OR）和95%置信區(qū)間（95%CI）表示不同基因型與臨床表型相關(guān)性強(qiáng)度.

2 結(jié)果

2.1 樣品DNA的提取

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳，與標(biāo)準(zhǔn)Marker對(duì)照得到3種基因型：II型(插入純合子，只含490bp片段),DD型(缺失純合子，只含190bp片段),ID型(缺失與插入雜合子，含490bp和190bp兩片段)(見(jiàn)圖1).先對(duì)所調(diào)查人群的基因型及等位基因頻率進(jìn)行分析，確認(rèn)符合Hardy-Weinberg平衡.

圖1 維吾爾族ACE基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 2型糖尿病組、糖耐量異常組及正常糖耐量組一般臨床特征比較

比較三組的性別構(gòu)成、年齡、體重指數(shù)、腰臀比(見(jiàn)表1，表2).

表2 柯?tīng)柨俗巫?組臨床特征比較

2.3 2型糖尿病組、糖耐量異常組、正常糖耐量組ACE基因型及等位基因頻率分布

經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)，ACE基因多態(tài)性的基因型及等位基因頻率分布在病例組和對(duì)照組達(dá)到遺傳平衡(P>0.05)，表明該研究對(duì)象來(lái)自大的群體，個(gè)體間為隨機(jī)婚配，無(wú)明顯的自然選擇、遷移等因素對(duì)遺傳平衡的影響吻合度好，資料代表性好.（見(jiàn)表3，表4）

表3 維吾爾族3組間AEC基因型和基因頻率分布(%)

表4 柯?tīng)柨俗巫?組間AEC基因型和基因頻率分布(%)

2.4 糖調(diào)節(jié)異常組（T2DM+IGT）與正常糖耐量組（NGT）基因型及等位基因頻率分布比較

分別合并兩個(gè)少數(shù)民族T2DM與糖耐量減低組為糖代謝異常組，與糖耐量正常組的等位基因和基因型頻率比較采用x2檢驗(yàn).（見(jiàn)表5，表6）

表5 維吾爾族2組間的ACE基因和多態(tài)性分析

表6 柯?tīng)柨俗巫?組間的ACE基因和多態(tài)性分析

2.5 2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)因素分析

表7 維吾爾族和柯?tīng)柨俗巫逄谴x異常組與NGT組ACE基因多態(tài)性風(fēng)險(xiǎn)度分析

將單因素分析中與2型糖尿病有關(guān)的指標(biāo)通過(guò)Logistic回歸進(jìn)行分析.經(jīng)風(fēng)險(xiǎn)度分析發(fā)現(xiàn)，在維吾爾族T2DM組中攜帶DD、ID、ID+DD基因型發(fā)生的個(gè)體較攜帶II基因型的個(gè)體發(fā)生糖代謝異常（T2DM+IGT）的危險(xiǎn)性增加(OR=7.812，95%CI=3.135-19.607;OR=4.854，95%CI=1.835-12.821;OR=6.410，95%CI=2.865-14.286)，攜帶D等位基因的個(gè)體較攜帶I等位基因的個(gè)體發(fā)生糖代謝異常（T2DM+IGT）的危險(xiǎn)性增加（OR=4.444，95%CI=2.617-7.576)，而柯?tīng)柨俗巫錎D、ID+DD基因型和D等位基因性對(duì)糖代謝異常（T2DM+IGT）的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低（見(jiàn)表7）.

3 討論

近年來(lái)，關(guān)于ACE基因多態(tài)性與糖尿病關(guān)系的研究報(bào)道日趨多見(jiàn)，但其結(jié)論差異很大.在非洲和歐洲人群中研究發(fā)現(xiàn)ACE基因多態(tài)性與糖尿病有關(guān)聯(lián)[12,13]，而在亞洲人中則無(wú)關(guān)聯(lián)[14?18].表明ACE基因多態(tài)性與糖尿病的關(guān)系存在著種族或民族差異，這就要求在探討ACE基因多態(tài)性與糖尿病關(guān)系時(shí)，應(yīng)在不同種族或民族間進(jìn)行.我國(guó)新疆少數(shù)民族人群與外界相對(duì)隔離，極少與外族通婚，遺傳背景較為一致，是我國(guó)特有的隔離人群遺傳資源；新疆的許多少數(shù)民族（如維吾爾族、柯?tīng)柨俗巫?、塔吉克族、哈薩克族等）素有高脂肪、高蛋白飲食的習(xí)慣，有較高的糖脂代謝紊亂的患病率，是研究糖尿病相關(guān)的民族特異性潛在生物標(biāo)志物的寶貴人群資源.本研究選取新疆地區(qū)維吾爾族、柯?tīng)柨俗巫逄悄土空Ｈ巳?、糖耐量減低人群及2型糖尿病患者為研究對(duì)象.單因素分析結(jié)果顯示：同一民族病例組（T2DM與IGT）與對(duì)照組年齡、BMI、WHR情況差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；T2DM組與IGT組的差異大多不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，合并此兩組為糖代謝異常組.合并前后，ACE基因多態(tài)性的組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.logistic回歸分析結(jié)果表明，DD基因型（D等位基因）可能是南疆（和田民豐）維吾爾族患2型糖尿病的危險(xiǎn)因素，柯?tīng)柨俗巫宓谋Ｗo(hù)因素.ACE基因多態(tài)性可能與2型糖尿病患病有關(guān)，同一等位基因不同民族間致病機(jī)制可能不同.