曾 敬，康艷紅，田 鵬，蘇桂田

（沈陽師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，沈陽 110034）

0 引 言

水凝膠合成材料的多樣性使人們能更加靈活地設(shè)計出具有不同特性的藥物控制釋放體系。天然高分子材料，如多糖和蛋白，由于其良好的生物相容性、低毒性、對酶的易感性，在用作制備水凝膠的材料方面，引起了人們廣泛的興趣。在這些高分子中，多糖還具有其獨特的優(yōu)點，如無免疫原性、無傳播動物源病菌的潛在危險性等。其中的一個多糖就是殼聚糖。殼聚糖具有其他天然高分子材料的優(yōu)點，又不會引發(fā)免疫反應(yīng)。

殼聚糖不同于其他多糖，其分子結(jié)構(gòu)中存在氨基，可被質(zhì)子化，能形成聚電解質(zhì)絡(luò)合物。殼聚糖無毒、穩(wěn)定、可生物降解、殺菌，在生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用［1］，使之成為藥物控制釋放領(lǐng)域中的理想載體。

通過物理交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)，殼聚糖可制成包括液體凝膠、粉末、顆粒、薄膜、片劑、膠囊、微球、微粒、紗布、納米纖維及無機共混物等各種形狀、各種尺寸的水凝膠劑型。

1 物理作用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

1.1 離子絡(luò)合物

由于殼聚糖氨基正離子的存在，使殼聚糖與帶負電荷的分子之間可發(fā)生離子相互作用，形成離子絡(luò)合物，如帶負離子的小分子硫酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽，金屬負離子如Pt（Ⅱ）、Pd（Ⅲ）、Mo（Ⅵ）。通過調(diào)整電荷密度、陰離子的尺寸以及調(diào)整殼聚糖的脫乙酰度和密度，可制備出各種不同性能的水凝膠材料。

帶負離子的小分子與殼聚糖的結(jié)合都是通過殼聚糖質(zhì)子化的氨基，而金屬離子與殼聚糖間的結(jié)合是通過配位共價鍵而非靜電作用。這種配位共價鍵的作用要強于靜電吸引作用。另外，金屬陰離子的電荷密度由pH值決定，而殼聚糖及一些小分子的球電荷密度則既受pH值影響，也受材料本身的pKa值決定。殼聚糖在pH 6以上時，就幾乎不帶電荷，這大大限制了其形成離子絡(luò)合物的能力，進而限制了其在生理條件下的應(yīng)用。同樣，陰離子分子應(yīng)具有高電荷密度，以形成強有力的靜電作用，同時，分子量要小，以利于其自由地在高分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中擴散進而發(fā)生靜電作用。

1.2 物理混合物和次級作用力

除了前面介紹的通過幾種特定的物理相互作用形成水凝膠之外，還可通過將殼聚糖與其他水溶性非離子型高分子（如PVA）共混獲得。這些高分子混合物在凍干后或若干冷凍－解凍循環(huán)后形成微晶或絡(luò)合結(jié)點，即水凝膠的交聯(lián)點。對于殼聚糖－PVA共混物，如增加殼聚糖含量則會削弱PVA形成微晶的能力，增加所形成水凝膠的無序性。

最近，一種新型的殼聚糖與聚乙烯亞胺（PEI）共混的水凝膠被制備出來［2］。PEI是陽離子聚合物，可廣泛地用作基因轉(zhuǎn)染試劑。通過與殼聚糖共混，一種3D水凝膠5min就可制備出來。這種水凝膠在細胞培養(yǎng)條件下性質(zhì)穩(wěn)定，可支撐人體胎兒骨骼細胞的生長。如果制備水凝膠時pH 7.5，則殼聚糖是不溶的，可能導(dǎo)致鏈間形成結(jié)晶。即使不加任何其他高分子材料或絡(luò)合物，殼聚糖自身也能形成水凝膠。Ladet等通過凝膠形成的氫醇法對此進行了解釋［3］。氫醇法中，用氫氧化鈉溶液處理殼聚糖以使殼聚糖上的氨基游離出來，這樣就避免了高分子鏈間的離子排斥力，就可能形成氫鍵、疏水相互作用、殼聚糖結(jié)晶等。通過這種技術(shù)可制備出立方厘米尺寸的水凝膠。如果在制備過程中降低溶液的堿性，則凝膠尺寸大幅減小，隨著堿性的進一步降低，凝膠的損耗程度也增加。有趣的是，通過間歇凝膠法可制備多層洋蔥樣水凝膠（如圖1），可用于在多種治療手段中或脈沖式給藥中實現(xiàn)對多種藥物的共擔(dān)載［4］。

圖1 多層洋蔥樣水凝膠［4］

1.3 熱可逆水凝膠和疏水締合作用

研究者打造了一系列被稱作熱可逆凝膠的水凝膠體系，根據(jù)環(huán)境溫度的不同可呈現(xiàn)瞬時凝膠態(tài)或液體狀態(tài)。這些高分子通過疏水相互作用或次級作用力在鏈間形成結(jié)點，從而在可流動性液體溶液中形成一個半剛性的水凝膠。特殊的是當(dāng)系統(tǒng)達到一個較低的臨界溫度（LCST）值時，材料會發(fā)生親水－疏水性互變現(xiàn)象。在室溫條件下具有較低濃度的高分子溶液，當(dāng)溫度高于LCST值時就會形成凝膠，這種性能在材料的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面是極其重要的。這些材料可以以液體的形式注入人體，當(dāng)人體某個部位溫度高于LCST時，就在原處形成凝膠，這樣可望成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的一種新型載體［5］。這些可注射的凝膠體系可通過外科手術(shù)進入體內(nèi)，可傳遞生物活性物質(zhì)到達病灶部位而無明顯的副反應(yīng)（如局部過熱、有機溶劑的作用、毒副產(chǎn)物的形成等）。在臨床使用中，可注射的水凝膠特別適用于治療一些形狀不規(guī)則的病灶，而不用對傳統(tǒng)支架結(jié)構(gòu)進行設(shè)計和修整。

甘油磷酸二鈉鹽（GP）和殼聚糖物理共混物有對濕度敏感的性質(zhì)。GP中的磷酸鹽部分有中和殼聚糖中氨基的作用，從而在溫度升高的過程中可增強殼聚糖的疏水性和殼聚糖鏈間氫鍵的形成。室溫下該混合物為一澄清的液體，在37℃時變成凝膠［6］。殼聚糖／GP凝膠可傳遞生物活性骨蛋白，還可以作為軟骨細胞的擔(dān)載基質(zhì)，三周后可在活體內(nèi)生長出正常的軟骨組織。

Bhattarai等利用殼聚糖鏈間的相互作用，以Schiff堿和氰基硼氫化鈉為催化劑化學(xué)接枝單羥基PEG到殼聚糖骨架上，也制備出了可注射的溫度可逆凝膠［7］。優(yōu)化PEG用量（45%～55%）和PEG MW（即親水和疏水基團的比例平衡），共聚物表現(xiàn)出溫度可逆互變特性，在室溫條件下為可注射液體，在體溫條件下變成凝膠。因此，可在低于溶膠－凝膠轉(zhuǎn)變溫度下用注射器注射，當(dāng)高于溶膠－凝膠轉(zhuǎn)變溫度時，溶液轉(zhuǎn)變成透明凝膠。在低溫下，PEG主要與水分子形成氫鍵，較高溫度時，則主要是與高分子鏈間的疏水相互作用占主導(dǎo)。這種親水／疏水特性的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致了凝膠的形成。

2 化學(xué)交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

盡管物理交聯(lián)的水凝膠有一系列優(yōu)點，但同時也存在局限性，物理凝膠的孔隙尺寸、化學(xué)行為、降解或溶解行為在體內(nèi)都很難控制。

為避免上述缺陷，可制備殼聚糖不可逆網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)水凝膠。這些水凝膠的高分子鏈都是通過小分子交聯(lián)劑或二次聚合等作用共價鍵合在一起的?；瘜W(xué)交聯(lián)水凝膠的性質(zhì)主要受交聯(lián)密度及交聯(lián)劑與高分子結(jié)構(gòu)重復(fù)單元的摩爾比的影響。下面分別介紹不可逆殼聚糖基水凝膠的不同形成方式。

2.1 小分子交聯(lián)劑

許多雙官能團的小分子都可被用作殼聚糖的交聯(lián)劑，包括戊二醛、二縮水甘油醚、二異氰酸酯、二丙烯酸酯等。與物理凝膠相比，這些化學(xué)交聯(lián)凝膠的機械性能明顯提高。但是許多交聯(lián)劑的生物相容性還不清楚，很多交聯(lián)劑還發(fā)現(xiàn)具有相對的生物毒性。為了防止痕跡量未反應(yīng)的交聯(lián)劑在體內(nèi)造成的影響，化學(xué)交聯(lián)的水凝膠在使用前必須進行嚴格的純化。另外，有些交聯(lián)劑還會與水凝膠擔(dān)載物反應(yīng)，限制了所擔(dān)載物質(zhì)的釋放。目前，可供選擇的安全的、生物相容性好的共價交聯(lián)劑十分有限，這也是共價交聯(lián)水凝膠的主要缺點。

由桅子中提取出的京尼平（genipin）是一種純天然的新型交聯(lián)劑，具有良好的生物相容性［8］，可有效共價交聯(lián)殼聚糖和明膠等含有氨基的高分子，與戊二醛相比具有較少的細胞毒性。而且，用京尼平交聯(lián)的殼聚糖比用戊二醛交聯(lián)的殼聚糖降解速率更慢。另外，用京尼平交聯(lián)的殼聚糖也表現(xiàn)出更長的藥物釋放時間。盡管京尼平具有良好的生物相容性，但其還是易與所擔(dān)載藥物發(fā)生反應(yīng)，這也是京尼平在藥物控制釋放領(lǐng)域的應(yīng)用中所需要考慮的一個問題。

2.2 高分子－高分子交聯(lián)

為了避免在制備水凝膠的過程中使用交聯(lián)劑，研究人員事先將高分子鏈功能化，使其帶有可反應(yīng)的官能團，然后在原位共價交聯(lián)形成水凝膠。依據(jù)交聯(lián)反應(yīng)速度及所選擇要發(fā)生反應(yīng)的官能團，則可以形成不同類型的共價交聯(lián)點。

在生理pH值下，將N－琥珀?；臍ぞ厶桥c醛基為終端的透明質(zhì)酸混合在一起1～4min，就可以生成Schiff堿［9］，反應(yīng)條件溫和，生成的水凝膠可至少在4W時間內(nèi)保持穩(wěn)定，并且可擔(dān)載軟骨細胞。

通過邁克爾加成反應(yīng)也可使高分子鏈間交聯(lián)，形成水凝膠。如，殼聚糖的氨基作為親核試劑與其他高分子鏈上的乙烯基進行反應(yīng)。這種方法的反應(yīng)速率快，在反應(yīng)中能形成不同類型的共價鍵，與生物分子的反應(yīng)相對溫和，因此目前很流行［10］。用丙烯酸?；臍ぞ厶桥c硫醇化的PEO反應(yīng)，制備出了殼聚糖－PEO水凝膠［11］。研究表明，利用活性硫醇及通過邁克爾加成反應(yīng)制備的高分子具有明顯的黏附性，在對口腔的藥物緩釋治療方面提供了支持。

2.3 光交聯(lián)

高分子可利用對光敏感的官能團進行交聯(lián)形成水凝膠。這種技術(shù)具有制備方法簡單、反應(yīng)速率快、安全性高、成本低等優(yōu)點，而傳統(tǒng)的化學(xué)交聯(lián)法則往往需要加入一些活性物種、引發(fā)劑或催化劑等。

通過將殼聚糖鏈上引入功能基團疊氮基，可實現(xiàn)原位光敏交聯(lián)獲得殼聚糖水凝膠。紫外光照射后，疊氮基轉(zhuǎn)化成氮賓基，與殼聚糖上的游離氨基反應(yīng)成鍵，60s內(nèi)就可形成水凝膠。這種殼聚糖水凝膠能夠控制多種生長因子的釋放速率，是一種新型的生長因子載體，可以在體內(nèi)誘導(dǎo)新血管的形成［12］。

通過光交聯(lián)，還可制備熱敏性殼聚糖－聚醚水凝膠。用丙烯酸酯將殼聚糖功能化后再和聚醚混合，然后用UV照射可發(fā)生交聯(lián)。殼聚糖－聚醚水凝膠對包埋的人體生長因子hGH和質(zhì)粒DNA均表現(xiàn)出持續(xù)的釋放性能［13－14］。

2.4 酶交聯(lián)

光敏交聯(lián)高分子水凝膠可在原位形成，有許多優(yōu)勢，但也存在缺點，如交聯(lián)需要一定的光敏劑和一定的輻射時間。這可能導(dǎo)致機體局部溫度升高，進而損傷鄰近的細胞和組織。用酶催化高分子交聯(lián)是一種溫和的新方法。這項技術(shù)在組織工程支架、藥物或蛋白的傳遞等生物醫(yī)藥領(lǐng)域已顯示出很大的應(yīng)用前景。辣根過氧化酶（HRP）是一種單鏈β－型血紅素蛋白，通過氫過氧化物的分解，可催化酚或苯胺衍生物的偶合，起到交聯(lián)作用［15］。

近年來，Jin等利用乙醇酸接枝的水溶性殼聚糖和根皮酸（PA）在辣根過氧化酶和過氧化氫催化下進行交聯(lián)，制備了一種可注射的殼聚糖基水凝膠［16］。控制高分子的濃度為1%～3%，可使凝膠形成時間控制在10s～4min。通過改變初始高分子的濃度，可有效調(diào)節(jié)水凝膠的凝膠含量、吸水性、酶降解時間及機械性能。酪氨酸酶是動物和植物組織內(nèi)的一種氧化酶，可用來交聯(lián)殼聚糖和明膠，在原位形成水凝膠。酪氨酸酶氧化明膠的酪氨酰殘基，形成醌殘基，與殼聚糖的氨基作用，形成分子間的交聯(lián)點。殼聚糖和明膠的交聯(lián)在30min內(nèi)，適于凝膠的原位應(yīng)用。

3 藥物的擔(dān)載

作為藥物載體的水凝膠，其藥物擔(dān)載和釋放性能一方面取決于水凝膠的物理和化學(xué)性質(zhì)，另一方面也取決于治療本身。實際上，水凝膠材料的選擇、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成、藥物擔(dān)載的機理都應(yīng)充分考慮，以彌補藥物本身性質(zhì)的不足（如脂溶性、帶電荷等）及藥物作用機理的不足（如釋放速率是否太快、藥物是否是高度裸露等）。藥物的擔(dān)載主要有3種方法：擴散、包埋、栓系。每種方法都有自己的優(yōu)點和缺點，選擇哪種方法應(yīng)充分考慮所使用的水凝膠的特性及所擔(dān)載藥物的特性。

最簡單的藥物擔(dān)載方法是將充分形成的水凝膠置入被藥物所飽和的介質(zhì)中［17］。依據(jù)水凝膠孔徑的大小、藥物的尺寸及它們的化學(xué)性質(zhì)，藥物分子會緩慢擴散至水凝膠中。當(dāng)水凝膠置入體內(nèi)，藥物會自由擴散出水凝膠，進入鄰近組織。這種方法對小分子藥物的擔(dān)載十分有效，但像多肽、蛋白這樣的大分子藥物，則不易在水凝膠的小孔隙中移動。而且，這種方法進行的藥物擔(dān)載也需耗費很長的時間。對于較大的藥物分子，則須將藥物與高分子溶液混合，然后再加交聯(lián)劑進行交聯(lián)，在凝膠化過程中將藥物分子包埋其中。需要注意的是，必須充分考慮藥物分子的化學(xué)性質(zhì)，避免不必要的交聯(lián)及藥物活性的降低。

無論是擴散方法還是包埋方法，藥物分子都可以自由從凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中出來。凝膠置入體內(nèi)后，由于凝膠與周圍藥物濃度的差異，會導(dǎo)致置入前期藥物的突釋。為了盡可能地減少所擔(dān)載藥物的損失及機體中毒的可能，可在凝膠化前將藥物分子共價鍵合到高分子鏈上或以物理方法連接到高分子鏈上。當(dāng)水凝膠分解或藥物分子與高分子間的價鍵斷裂時，藥物分子才會釋放出來，起到治療作用。藥物與高分子間的連接易受周圍環(huán)境中酶的影響，可以此來控制藥物的釋放速率和釋放時間。

分子之間如果溶解性不同，或帶有相同的電荷，那么在進行藥物擔(dān)載時也是很難處理的。如，像紫杉醇這樣的疏水分子，必須在制備水凝膠前，將其與兩親性添加物混合，然后在溶液中共混進行擔(dān)載。Jauhari等將紫杉醇與檸檬酸甘油單酯共混，然后再凝膠化，實現(xiàn)了對紫杉醇的擔(dān)載［18］。

4 藥物的釋放

水凝膠所擔(dān)載的藥物的釋放可通過3種不同的方式進行：擴散方式、化學(xué)／環(huán)境應(yīng)答方式及特定酶的應(yīng)答方式。藥物的擴散釋放可通過調(diào)整藥物分子在高分子基質(zhì)間的運動或調(diào)整水凝膠在體內(nèi)的分解速率來調(diào)控。具有環(huán)境應(yīng)答功能的水凝膠會根據(jù)周圍pH和溫度條件的不同，有效膨脹擴張其孔徑，從而在所設(shè)定的條件下提高所包埋藥物的擴散速率。這種藥物控制釋放模式可在治療部位保持有效的藥物水平，并避免藥物在病灶以外的部位發(fā)生釋放。

通過擴散進行的局部藥物控制釋放是一種最基本的非特異性的控制釋放方式，而化學(xué)或生物環(huán)境刺激引起的藥物釋放則更具有可調(diào)控性和可選擇性，可避免藥物在到達病灶部位前與大量健康組織發(fā)生相互作用。這一點是十分重要的。

環(huán)境應(yīng)答或酶應(yīng)答誘發(fā)水凝膠發(fā)生3種變化：膨脹、分解或降解，從而有利于藥物的釋放。水凝膠的膨脹使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的孔徑增大，使水凝膠中包埋的藥物可以以更快的速度擴散出來。而分解或降解則是水凝膠的物理解體。當(dāng)高分子鏈間的交聯(lián)點或結(jié)合的分子斷裂時，即水凝膠發(fā)生分解，藥物就釋放出來。

5 展 望

由于交聯(lián)機理的發(fā)展，新的材料的出現(xiàn)，水凝膠的種類也發(fā)展得越來越多。這些凝膠具有孔徑、機械強度和尺寸可調(diào)性，以應(yīng)用于不同領(lǐng)域。殼聚糖更是由于其獨特的陽離子特性，及在體內(nèi)的降解機理而在水凝膠領(lǐng)域中占有相當(dāng)重要一席。

殼聚糖是智能藥物控制釋放領(lǐng)域中最主要的一員，可在注射藥物控制釋放體系、腫瘤治療的原位凝膠體系、組織再生、口腔藥物傳遞等領(lǐng)域都受到了強烈的關(guān)注。

可以預(yù)見，當(dāng)進一步掌握殼聚糖基網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的動力學(xué)后，還會產(chǎn)生新一代的藥物傳遞體系。便宜、無毒、有效的殼聚糖基水凝膠藥物控制釋放體系會與臨床應(yīng)用越來越近。

［1］曾敬，趙桂貞，段紀東，等.天然高分子材料甲殼素和殼聚糖及其衍生物［J］.沈陽師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2006，24（3）：325－329.

［2］KHAN F，TARE R S，OREFFO R O C，et al.Versatile biocompatible polymer hydrogels：scaffolds for cell growth［J］.Angew Chem Int Ed，2009，48：978－982.

［3］LADET S，DAVID L，DOMARD A.Multi－membrane hydrogels［J］.Nature，2008，452：76－79.

［4］CHEN R R，SILVA E A，YUEN W W，et al.Integrated approach to designing growth factor delivery systems［J］.FASEB J，2007，21：3896－3903.

［5］KRETLOW J D，KLOUDA L，MIKOS A G.Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering［J］.Adv Drug Deliv Rev，2007，59：263－273.

［6］CHENITE A，CHAPUT C，WANG D，et al.Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ［J］.Biomaterials，2000，21：2155－2161.

［7］BHATTARAI N，RAMAY H R，GUNN J，et al.PEG－grafted chitosan as an injectable thermosensitive hydrogel for sustained protein release［J］.J Control Release，2005，103：609－624.

［8］JIN J，SONG M，HOURSTON D J.Novel chitosan－based films cross－linked by genipin with improved physical properties［J］.Biomacromolecules，2004，5：162－168.

［9］TAN H，CHU C R，PAYNE K A，et al.Injectable in situ forming biodegradable chitosan－h(huán)yaluronic acid based hydrogels for cartilage tissue engineering［J］.Biomaterials，2009，30：2499－2506.

［10］METTERS A，HUBBELL J.Network formation and degradation behavior of hydrogels formed by Michael－type addition reactions［J］.Biomacromolecules，2006，7：290－301.

［11］KIM M S，CHOI Y J，NOH I，et al.Synthesis and characterization of in sytu chitosan－based hydrogel via grafting of carboxyethyl acrylate［J］.J Biomed Mater Res，A 2007，83：674－682.

［12］ISHIHARA M，OBARA K，ISHIZUKA T，et al.Controlled release of fibroblast growth factors and heparin from photocrosslinked chitosan hydrogels and subsequent effect on in vivo vascularization［J］.J Biomed Mater Res，Part A，2003，64A（3）：551－559.

［13］YOO H S.Photo－cross－linkable and thermo－responsive hydrogels containing chitosan and pluronic for sustained release of human growth hormone（hGH）［J］.J Biomater Sci Polym Ed，2007，18：1429－1441.

［14］LEE J I，KIM H S，YOO H S.DNA nanogels composed of chitosan and Pluronic with thermo－sensitive and photocrosslinking properties［J］.Int J Pharm，2009，373：93－99.

［15］SAKAI S，YAMADA Y，ZENKE T，et al.Novel chitosan derivative soluble at neutral pH and in－situ gellable via peroxidase－catalyzed enzymatic reaction［J］.J Mater Chem，2009，19：230－235.

［16］JIN R，MOREIRA TEIXEIRA L S，DIJKSTRA P J，et al.Injectable chitosan－based hydrogels for cartilage tissue engineering［J］.Biomaterials，2009，30：2544－2551.

［17］SOKKER H H，GHAFFAR A M A，GAD Y H，et al.Synthesis and characterization of hydrogels based on gfafted chitosan for the controlled drug release［J］.Carbohydr Polym，2009，75：222－229.

［18］JARHARI S，DASH A K.A mucoadhesive in situ gel delivery system for paclitaxel［J］.AAPS Pharm Sci Tech，2006，7：E154－E159.