王翠杰 ，黃永東，孔英俊，羅堅(jiān)，張貴鋒，趙東旭，蘇志國(guó)，馬光輝

1 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100086

2 中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所 生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

抗凝血酶Ⅲ (Antithrombin Ⅲ，AT Ⅲ)是血漿中最重要的一個(gè)抗凝血酶因子[1]，在維持血液的凝血與抗凝血平衡中起重要作用[2]。AT Ⅲ的分子量為58?64 kDa，等電點(diǎn)為5.1。目前，AT Ⅲ有3種來(lái)源，從血漿中純化[3]、用基因工程細(xì)胞生產(chǎn)[4]和用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)[5-6]。乳腺生物反應(yīng)器能夠生產(chǎn)出具有正確氨基酸序列的人源蛋白質(zhì)，能進(jìn)行翻譯后修飾，蛋白具有生物活性，且表達(dá)量高，很容易通過(guò)增加飼養(yǎng)動(dòng)物的規(guī)模來(lái)獲得大量的重組蛋白[7-8]。因此，利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)rhAT Ⅲ具有廣闊的應(yīng)用前景。

青島森淼實(shí)業(yè)有限公司開展了利用嶗山奶山羊乳腺生物反應(yīng)器制備藥用蛋白的研究工作，建立了乳腺生物反應(yīng)器的開發(fā)平臺(tái)[9-10]，其中利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)rhAT Ⅲ已經(jīng)達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)的要求，在此基礎(chǔ)上開發(fā)一條高效的分離純化工藝將有助于推進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。已有的從轉(zhuǎn)基因羊奶中提取rhAT Ⅲ的純化工藝主要包含切向流過(guò)濾、肝素親和層析、超濾、陰離子交換層析、疏水層析和超濾，總蛋白收率為53%[5]。該工藝由六步組成，操作過(guò)于繁瑣、純化周期長(zhǎng)，不利于產(chǎn)品的快速、規(guī)?；苽浜统杀究刂?。

羊奶中的蛋白主要為酪蛋白，含量超過(guò)70%，本研究首先通過(guò)篩選有效的預(yù)處理方法，去除羊奶中的大部分酪蛋白，再通過(guò)肝素親和層析將rhAT Ⅲ與其他蛋白分開，快速有效地將rhAT Ⅲ提取出來(lái)，減少操作步驟，提高收率，為今后的規(guī)?；苽涮峁﹨⒖寂c依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑材料與儀器

轉(zhuǎn)基因羊奶 (青島森淼實(shí)業(yè)有限公司)；血漿抗凝血酶Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)品 (Chromogenix，ITA)；Heparin QZT 6FF親和介質(zhì) (國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心，北京)、DEAE Sepharose FF陰離子交換介質(zhì)和Phenyl Sepharose FF疏水介質(zhì) (GE，USA)；其他試劑均為分析純。

離心機(jī) H-2050R (湘儀集團(tuán))；層析系統(tǒng)?KTA purifier (GE，USA)；電泳儀 Mini-Protein Ⅲ(Bio-Rad，USA)；分光光度計(jì) Ultrospec 2100-pro(GE，USA)；450型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 (Bio-Rad，USA)。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因羊奶預(yù)處理

取出適量保存在-20 ℃的轉(zhuǎn)基因羊奶，4 ℃融化后離心 (10 000×g，4 ℃，30 min)，去除沉淀和漂浮的奶脂，留上清液備用。

等電點(diǎn)沉淀法：往上清液中加入等體積去離子水，然后用1 mol/L鹽酸調(diào)pH至4.6。靜置沉淀 1 h 后離心 (10 000×g，4 ℃，30 min)，上清用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，調(diào)pH備用。

乙二胺四乙酸 (EDTA)沉淀法、鈣離子 (Ca2+)沉淀法和鋅離子 (Zn2＋)沉淀法：分別往上清液中加入等體積20 mmol/L EDTA、40 mmol/L CaCl2和40 mmol/L ZnCl2溶液，靜置沉淀1 h后離心 (10 000×g，4 ℃，30 min)，上清用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，調(diào)pH備用。

1.2.2 溶液條件對(duì)rhAT Ⅲ穩(wěn)定性的影響

分別考察rhAT Ⅲ在不同pH (4.6、6.2、7.2、8.2和9.2)和溫度 (4 ℃和25 ℃)下的活性變化情況。

1.2.3 rhAT Ⅲ分離純化

1) 不同層析模式純化效果考察

DEAE陰離子交換層析：DEAE陰離子交換柱(6.37 cm × 1.0 cm I.D., CV = 5.0 mL)用平衡緩沖液Buffer A (20 mmol/L PB, pH 7.2)平衡后進(jìn)料 10 mL上清液，繼續(xù)用緩沖液A淋洗至基線，再采用線性梯度 (0?100% 緩沖液 B (20 mmol/L PB+1 mol/L NaCl, pH 7.2), 60 min)洗脫。

Phenyl疏水層析：Phenyl疏水柱 (6.37 cm ×1.0 cm I.D., CV = 5.0 mL)用平衡緩沖液Buffer C(20 mmol/L PB+1.5 mol/L (NH4)2SO4, pH 7.2)平衡后進(jìn)料10 mL上清液，繼續(xù)用緩沖液C淋洗至基線，再采用線性梯度 (0?100%緩沖液 D(20 mmol/L PB, pH 7.2), 60 min)進(jìn)行洗脫。

Heparin親和層析：Heparin親和柱 (6.37 cm ×1.0 cm I.D., CV = 5.0 mL)用平衡緩沖液 E(50 mmol/L Tris, pH 7.2)平衡后進(jìn)料10 mL上清液，繼續(xù)用緩沖液 E淋洗至基線，再采用線性梯度(0–100%緩沖液F (50 mmol/L Tris+ 0.5 mol/L NaCl,pH 7.2), 60 min)進(jìn)行洗脫。

2) 親和層析方法優(yōu)化

在Heparin親和層析過(guò)程中，分別考察了洗脫梯度 (線性梯度和階躍梯度)、pH (6.2?8.2)、流速(0.5?2.0 mL/min)和上樣量 (1?4 mL 料液/mL 肝素親和介質(zhì))對(duì)親和層析效果的影響。

1.3 分析方法

1.3.1 蛋白濃度檢測(cè)

采用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定[11]。

rhAT Ⅲ濃度檢測(cè)：采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行反相色譜分析[9]，根據(jù)rhAT Ⅲ濃度和峰高的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中的rhAT Ⅲ濃度。

1.3.2 rhAT Ⅲ活性檢測(cè)

采用龔道元等[12]報(bào)道的多肽底物發(fā)色法測(cè)定rhAT Ⅲ的生物活性。

1.3.3 電泳檢測(cè)

參考Laemmli法進(jìn)行SDS-PAGE電泳[13]，采用銀染法進(jìn)行染色[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料預(yù)處理

酪蛋白等電點(diǎn)為4.6，可利用等電點(diǎn)沉淀法將其沉淀出來(lái)。此外，酪蛋白在羊奶中通過(guò)磷酸鈣形成穩(wěn)定膠束存在，而EDTA能夠螯合磷酸鈣，Ca2＋、Zn2＋也能替代磷酸鈣，造成酪蛋白膠束的解聚，從而沉淀出來(lái)。4種沉淀方法的效果如表1所示，其中等電點(diǎn)沉淀和Zn2＋沉淀兩種方法對(duì)rhAT Ⅲ的含量和活性均無(wú)太大影響，但是Zn2+沉淀效果并不明顯，只有離心后才能出現(xiàn)澄清的上清液。等電點(diǎn)沉淀后，分層明顯，上清中總蛋白量減少50%左右，在不影響rhAT Ⅲ活性收率的情況下，有效去除羊奶中的酪蛋白。

表1 酪蛋白沉淀方法篩選結(jié)果Table 1 Results of casein precipitation methods

2.2 溶液條件對(duì)rhAT Ⅲ穩(wěn)定性的影響

在層析中，如何保持rhAT Ⅲ的活性是首要解決的問(wèn)題。pH、溫度和時(shí)間對(duì)rhAT Ⅲ活性保持的影響如圖1所示。由圖1可知，pH對(duì)其穩(wěn)定性影響顯著，pH 7.2的條件對(duì)原料的保存最有利，即使長(zhǎng)時(shí)間放置(24 h)，rhAT Ⅲ活性損失相對(duì)最小。此外，低溫 (4 ℃)比室溫 (25 ℃)更有利于樣品中rhAT III的活性保持。因此，利用等電點(diǎn)沉淀法去除酪蛋白后要盡快把樣品pH調(diào)至中性，放置于4 ℃冰箱中，并盡可能快速地進(jìn)行后續(xù)的純化實(shí)驗(yàn)，以保證活性收率。

2.3 層析模式對(duì)rhAT Ⅲ純化的影響

離子交換層析和疏水層析具有載量高、介質(zhì)成本低的優(yōu)勢(shì)，而肝素親和層析具有特異性高、分離純化效果好的特點(diǎn)，上述3種層析方法都已用于轉(zhuǎn)基因羊奶中rhAT Ⅲ的分離純化[4]。為了簡(jiǎn)化rhAT Ⅲ的分離純化步驟，本文對(duì)3種層析模式 (采用線性梯度洗脫)進(jìn)行比較，從中篩選出最有效的層析模式。

在離子交換和疏水層析中，除穿透峰 (P0)外，都只有1個(gè)洗脫峰 (P1, 圖略)；而在肝素親和層析中，大量雜蛋白直接穿透 (P0)，洗脫時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)明顯的洗脫峰 (P1, P2)，并且有較好的分離度 (圖略)。對(duì)層析所得的樣品進(jìn)行電泳分析 (圖2)，離子交換層析和疏水層析并不能很好地將rhAT Ⅲ和其他雜蛋白分開，而肝素親和層析的洗脫峰P1 (Lane 3)的條帶與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的rhAT Ⅲ的分子量60 kDa相符，為目標(biāo)蛋白rhAT Ⅲ，純度達(dá)到85%以上，進(jìn)一步優(yōu)化洗脫梯度有望達(dá)到更好的分離純化效果。

圖1 pH對(duì)rhAT Ⅲ穩(wěn)定性的影響Fig. 1 Effect of pH on rhAT Ⅲ stability.

2.4 溶液條件及洗脫條件對(duì)肝素親和層析純化效果的影響

2.4.1 洗脫梯度的影響

在線性梯度洗脫的基礎(chǔ)上，分別考察不同階躍 梯 度 (1： 0?20%?30%?50%?60%?100% ；2：0?50%?100%)的洗脫效果。采用階躍梯度1，各洗脫梯度下均有洗脫峰，但電泳分析結(jié)果表明，20%、30%和50%洗脫梯度對(duì)應(yīng)的洗脫峰無(wú)明顯區(qū)別(圖略)，均為高純度的rhAT Ⅲ，所以沒必要把洗脫梯度分得過(guò)于精細(xì)；直接用 0?50%?100%的洗脫梯度可以得到兩個(gè)洗脫峰 (圖 3)，其中50%梯度對(duì)應(yīng)的洗脫峰P1純度達(dá)到電泳純 (圖4，泳道 5)，該方法操作簡(jiǎn)單，短時(shí)間內(nèi)即可得到高純度的rhAT Ⅲ。

圖2 不同層析模式所得樣品的SDS-PAGE電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE analysis of rhAT Ⅲ eluted from different chromatography patterns. 1: marker; 2–4: P0, P1 and P2 of heparin affinity chromatography; 5: P1 of DEAE anion chromatography; 6:P1 of phenyl hydrophobic interaction chromatography.

圖3 肝素親和層析譜圖Fig. 3 Chromatogram of heparin affinity chromatography.

圖4 親和層析樣品的SDS-PAGE電泳圖Fig. 4 SDS-PAGE analysis of rhAT Ⅲ eluted from heparin affinity chromatography. 1: marker; 2: goat milk;3: supernatant of pH 7.2; 4: P0; 5: P1; 6: P2.

2.4.2 pH的影響

考察不同pH值 (pH 6.2、7.2、8.2)對(duì)rhAT Ⅲ分離純化的影響 (采用0?50%?100%洗脫梯度洗脫)。當(dāng)pH為6.2時(shí)，目標(biāo)洗脫峰P1最大，但其雜質(zhì)含量也最高；當(dāng)pH為7.2和8.2時(shí)，所得樣品的純度最高，無(wú)明顯雜質(zhì)。不同pH條件下目標(biāo)組分 (P1峰)中rhAT Ⅲ的活性收率分別為 20.6% (pH 6.2)、49.7%(pH 7.2)、13.9% (pH 8.2)，說(shuō)明pH不僅影響溶液中rhAT Ⅲ的活性保持 (圖1)，還對(duì)層析過(guò)程中rhAT Ⅲ的活性收率具有顯著影響。綜合考慮活性收率和純度，pH 7.2的條件最有利于rhAT Ⅲ的分離純化。

2.4.3 流速的影響

不同流速 (0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min)對(duì)層析效果的影響 (pH 7.2，采用0?50%?100%的梯度洗脫)如表2所示。流速太低 (0.5 mL/ min)時(shí)，蛋白在柱上停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，活性收率低；流速太高 (2.0 mL/min)時(shí)，不利于蛋白的有效吸附，活性收率較低；1.0?1.5 mL/min的流速有利于提高蛋白的活性收率。綜合考慮蛋白收率和活性收率，選擇1.0 mL/min的操作流速。

2.4.4 上樣量的影響

從表3可以看出，1和2 mL料液/mL介質(zhì)的上樣量的效果基本相當(dāng)；隨著上樣量的進(jìn)一步增加，rhAT Ⅲ的蛋白收率和活性收率都有下降趨勢(shì)，這主要是因?yàn)樯蠘恿窟^(guò)高，超過(guò)了介質(zhì)載量，造成部分目標(biāo)蛋白穿透。綜合考慮處理速度、蛋白收率和活性收率，選擇2 mL料液/mL介質(zhì)的上樣量。

2.4.5 層析過(guò)程 (吸附-解吸)對(duì)蛋白活性的影響

將 50%梯度洗脫所得的 P1峰用平衡緩沖液透析后再次進(jìn)行Heparin親和層析。結(jié)果表明rhAT Ⅲ的蛋白收率達(dá)到95%以上，但活性收率只有68%，存在明顯的活性損失現(xiàn)象。熒光光譜分析結(jié)果表明，rhAT Ⅲ再次進(jìn)行肝素親和層析后，其最大吸收波長(zhǎng)從原來(lái)的338.6 nm降低到334.2 nm，發(fā)生了藍(lán)移。由此可見，層析過(guò)程中的吸附-解吸過(guò)程是造成rhAT Ⅲ結(jié)構(gòu)變化和活性收率低的主要原因。

表2 不同流速條件的rhAT Ⅲ收率Table 2 Recovery of rhAT Ⅲ with different flow rate

表3 不同上樣量的rhAT Ⅲ收率Table 3 Recovery of rhAT Ⅲ with different sample loaded

2.5 rhAT Ⅲ結(jié)構(gòu)分析

所純化的rhAT Ⅲ經(jīng)胰蛋白酶和DTT降解后，通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用分析其氨基酸序列，結(jié)果表明rhAT Ⅲ的氨基酸覆蓋率達(dá)到82.6% (與血漿來(lái)源的AT Ⅲ相比)；二硫鍵定位結(jié)果表明rhAT Ⅲ中存在3個(gè)二硫鍵位置，分別是 Cys21-Cys95、Cys8-Cys128、Cys247-Cys430，與血漿來(lái)源的AT Ⅲ一致；糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果表明rhAT Ⅲ中存在4個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別為Asn96、Asn135、Asn155和Asn192，與血漿來(lái)源的AT Ⅲ一致[15-16]。上述分析結(jié)果表明所純化的rhAT Ⅲ的結(jié)構(gòu)與血漿來(lái)源的AT Ⅲ一致，結(jié)構(gòu)正確。

3 結(jié)論

本研究開發(fā)了一條基于等電點(diǎn)沉淀和肝素親和層析純化rhAT Ⅲ的工藝，重點(diǎn)考察了溶液條件和操作條件對(duì)rhAT Ⅲ蛋白收率和活性收率的影響，優(yōu)化了親和層析的操作條件 (pH 7.2、洗脫梯度為 0?50%?100%Buffer F、流速1.0 mL/min、上樣量2 mL料液/mL Heparin介質(zhì))，實(shí)現(xiàn)了rhAT Ⅲ的高效純化，純度達(dá)到99%以上，蛋白收率為 90%，活性收率約為 50%。與離子交換和疏水層析相比，肝素親和層析具有特異性強(qiáng)、分辨率高、產(chǎn)品回收率高的特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)液質(zhì)聯(lián)用、圓二色光譜、熒光光譜分析，所純化的rhAT Ⅲ與血漿來(lái)源AT Ⅲ結(jié)構(gòu)一致[16]。該工藝簡(jiǎn)化了rhAT Ⅲ分離純化的操作步驟，有利于工藝的進(jìn)一步放大和產(chǎn)品的規(guī)?；苽?。

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