国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx

乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)的重組人抗凝血酶Ⅲ的分離純化

2014-10-31 10:31王翠杰黃永東孔英俊羅堅(jiān)張貴鋒趙東旭蘇志國(guó)馬光輝
生物工程學(xué)報(bào) 2014年10期
關(guān)鍵詞:等電點(diǎn)抗凝血酶羊奶

王翠杰 ,黃永東,孔英俊,羅堅(jiān),張貴鋒,趙東旭,蘇志國(guó),馬光輝

1 北京理工大學(xué)生命學(xué)院,北京 100086

2 中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所 生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190

抗凝血酶Ⅲ (Antithrombin Ⅲ,AT Ⅲ)是血漿中最重要的一個(gè)抗凝血酶因子[1],在維持血液的凝血與抗凝血平衡中起重要作用[2]。AT Ⅲ的分子量為58?64 kDa,等電點(diǎn)為5.1。目前,AT Ⅲ有3種來(lái)源,從血漿中純化[3]、用基因工程細(xì)胞生產(chǎn)[4]和用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)[5-6]。乳腺生物反應(yīng)器能夠生產(chǎn)出具有正確氨基酸序列的人源蛋白質(zhì),能進(jìn)行翻譯后修飾,蛋白具有生物活性,且表達(dá)量高,很容易通過(guò)增加飼養(yǎng)動(dòng)物的規(guī)模來(lái)獲得大量的重組蛋白[7-8]。因此,利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)rhAT Ⅲ具有廣闊的應(yīng)用前景。

青島森淼實(shí)業(yè)有限公司開展了利用嶗山奶山羊乳腺生物反應(yīng)器制備藥用蛋白的研究工作,建立了乳腺生物反應(yīng)器的開發(fā)平臺(tái)[9-10],其中利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)rhAT Ⅲ已經(jīng)達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)的要求,在此基礎(chǔ)上開發(fā)一條高效的分離純化工藝將有助于推進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。已有的從轉(zhuǎn)基因羊奶中提取rhAT Ⅲ的純化工藝主要包含切向流過(guò)濾、肝素親和層析、超濾、陰離子交換層析、疏水層析和超濾,總蛋白收率為53%[5]。該工藝由六步組成,操作過(guò)于繁瑣、純化周期長(zhǎng),不利于產(chǎn)品的快速、規(guī)?;苽浜统杀究刂?。

羊奶中的蛋白主要為酪蛋白,含量超過(guò)70%,本研究首先通過(guò)篩選有效的預(yù)處理方法,去除羊奶中的大部分酪蛋白,再通過(guò)肝素親和層析將rhAT Ⅲ與其他蛋白分開,快速有效地將rhAT Ⅲ提取出來(lái),減少操作步驟,提高收率,為今后的規(guī)?;苽涮峁﹨⒖寂c依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑材料與儀器

轉(zhuǎn)基因羊奶 (青島森淼實(shí)業(yè)有限公司);血漿抗凝血酶Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)品 (Chromogenix,ITA);Heparin QZT 6FF親和介質(zhì) (國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心,北京)、DEAE Sepharose FF陰離子交換介質(zhì)和Phenyl Sepharose FF疏水介質(zhì) (GE,USA);其他試劑均為分析純。

離心機(jī) H-2050R (湘儀集團(tuán));層析系統(tǒng)?KTA purifier (GE,USA);電泳儀 Mini-Protein Ⅲ(Bio-Rad,USA);分光光度計(jì) Ultrospec 2100-pro(GE,USA);450型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 (Bio-Rad,USA)。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因羊奶預(yù)處理

取出適量保存在-20 ℃的轉(zhuǎn)基因羊奶,4 ℃融化后離心 (10 000×g,4 ℃,30 min),去除沉淀和漂浮的奶脂,留上清液備用。

等電點(diǎn)沉淀法:往上清液中加入等體積去離子水,然后用1 mol/L鹽酸調(diào)pH至4.6。靜置沉淀 1 h 后離心 (10 000×g,4 ℃,30 min),上清用0.45 μm的濾膜過(guò)濾,調(diào)pH備用。

乙二胺四乙酸 (EDTA)沉淀法、鈣離子 (Ca2+)沉淀法和鋅離子 (Zn2+)沉淀法:分別往上清液中加入等體積20 mmol/L EDTA、40 mmol/L CaCl2和40 mmol/L ZnCl2溶液,靜置沉淀1 h后離心 (10 000×g,4 ℃,30 min),上清用0.45 μm的濾膜過(guò)濾,調(diào)pH備用。

1.2.2 溶液條件對(duì)rhAT Ⅲ穩(wěn)定性的影響

分別考察rhAT Ⅲ在不同pH (4.6、6.2、7.2、8.2和9.2)和溫度 (4 ℃和25 ℃)下的活性變化情況。

1.2.3 rhAT Ⅲ分離純化

1) 不同層析模式純化效果考察

DEAE陰離子交換層析:DEAE陰離子交換柱(6.37 cm × 1.0 cm I.D., CV = 5.0 mL)用平衡緩沖液Buffer A (20 mmol/L PB, pH 7.2)平衡后進(jìn)料 10 mL上清液,繼續(xù)用緩沖液A淋洗至基線,再采用線性梯度 (0?100% 緩沖液 B (20 mmol/L PB+1 mol/L NaCl, pH 7.2), 60 min)洗脫。

Phenyl疏水層析:Phenyl疏水柱 (6.37 cm ×1.0 cm I.D., CV = 5.0 mL)用平衡緩沖液Buffer C(20 mmol/L PB+1.5 mol/L (NH4)2SO4, pH 7.2)平衡后進(jìn)料10 mL上清液,繼續(xù)用緩沖液C淋洗至基線,再采用線性梯度 (0?100%緩沖液 D(20 mmol/L PB, pH 7.2), 60 min)進(jìn)行洗脫。

Heparin親和層析:Heparin親和柱 (6.37 cm ×1.0 cm I.D., CV = 5.0 mL)用平衡緩沖液 E(50 mmol/L Tris, pH 7.2)平衡后進(jìn)料10 mL上清液,繼續(xù)用緩沖液 E淋洗至基線,再采用線性梯度(0–100%緩沖液F (50 mmol/L Tris+ 0.5 mol/L NaCl,pH 7.2), 60 min)進(jìn)行洗脫。

2) 親和層析方法優(yōu)化

在Heparin親和層析過(guò)程中,分別考察了洗脫梯度 (線性梯度和階躍梯度)、pH (6.2?8.2)、流速(0.5?2.0 mL/min)和上樣量 (1?4 mL 料液/mL 肝素親和介質(zhì))對(duì)親和層析效果的影響。

1.3 分析方法

1.3.1 蛋白濃度檢測(cè)

采用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定[11]。

rhAT Ⅲ濃度檢測(cè):采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行反相色譜分析[9],根據(jù)rhAT Ⅲ濃度和峰高的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中的rhAT Ⅲ濃度。

1.3.2 rhAT Ⅲ活性檢測(cè)

采用龔道元等[12]報(bào)道的多肽底物發(fā)色法測(cè)定rhAT Ⅲ的生物活性。

1.3.3 電泳檢測(cè)

參考Laemmli法進(jìn)行SDS-PAGE電泳[13],采用銀染法進(jìn)行染色[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料預(yù)處理

酪蛋白等電點(diǎn)為4.6,可利用等電點(diǎn)沉淀法將其沉淀出來(lái)。此外,酪蛋白在羊奶中通過(guò)磷酸鈣形成穩(wěn)定膠束存在,而EDTA能夠螯合磷酸鈣,Ca2+、Zn2+也能替代磷酸鈣,造成酪蛋白膠束的解聚,從而沉淀出來(lái)。4種沉淀方法的效果如表1所示,其中等電點(diǎn)沉淀和Zn2+沉淀兩種方法對(duì)rhAT Ⅲ的含量和活性均無(wú)太大影響,但是Zn2+沉淀效果并不明顯,只有離心后才能出現(xiàn)澄清的上清液。等電點(diǎn)沉淀后,分層明顯,上清中總蛋白量減少50%左右,在不影響rhAT Ⅲ活性收率的情況下,有效去除羊奶中的酪蛋白。

表1 酪蛋白沉淀方法篩選結(jié)果Table 1 Results of casein precipitation methods

2.2 溶液條件對(duì)rhAT Ⅲ穩(wěn)定性的影響

在層析中,如何保持rhAT Ⅲ的活性是首要解決的問(wèn)題。pH、溫度和時(shí)間對(duì)rhAT Ⅲ活性保持的影響如圖1所示。由圖1可知,pH對(duì)其穩(wěn)定性影響顯著,pH 7.2的條件對(duì)原料的保存最有利,即使長(zhǎng)時(shí)間放置(24 h),rhAT Ⅲ活性損失相對(duì)最小。此外,低溫 (4 ℃)比室溫 (25 ℃)更有利于樣品中rhAT III的活性保持。因此,利用等電點(diǎn)沉淀法去除酪蛋白后要盡快把樣品pH調(diào)至中性,放置于4 ℃冰箱中,并盡可能快速地進(jìn)行后續(xù)的純化實(shí)驗(yàn),以保證活性收率。

2.3 層析模式對(duì)rhAT Ⅲ純化的影響

離子交換層析和疏水層析具有載量高、介質(zhì)成本低的優(yōu)勢(shì),而肝素親和層析具有特異性高、分離純化效果好的特點(diǎn),上述3種層析方法都已用于轉(zhuǎn)基因羊奶中rhAT Ⅲ的分離純化[4]。為了簡(jiǎn)化rhAT Ⅲ的分離純化步驟,本文對(duì)3種層析模式 (采用線性梯度洗脫)進(jìn)行比較,從中篩選出最有效的層析模式。

在離子交換和疏水層析中,除穿透峰 (P0)外,都只有1個(gè)洗脫峰 (P1, 圖略);而在肝素親和層析中,大量雜蛋白直接穿透 (P0),洗脫時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)明顯的洗脫峰 (P1, P2),并且有較好的分離度 (圖略)。對(duì)層析所得的樣品進(jìn)行電泳分析 (圖2),離子交換層析和疏水層析并不能很好地將rhAT Ⅲ和其他雜蛋白分開,而肝素親和層析的洗脫峰P1 (Lane 3)的條帶與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的rhAT Ⅲ的分子量60 kDa相符,為目標(biāo)蛋白rhAT Ⅲ,純度達(dá)到85%以上,進(jìn)一步優(yōu)化洗脫梯度有望達(dá)到更好的分離純化效果。

圖1 pH對(duì)rhAT Ⅲ穩(wěn)定性的影響Fig. 1 Effect of pH on rhAT Ⅲ stability.

2.4 溶液條件及洗脫條件對(duì)肝素親和層析純化效果的影響

2.4.1 洗脫梯度的影響

在線性梯度洗脫的基礎(chǔ)上,分別考察不同階躍 梯 度 (1: 0?20%?30%?50%?60%?100% ;2:0?50%?100%)的洗脫效果。采用階躍梯度1,各洗脫梯度下均有洗脫峰,但電泳分析結(jié)果表明,20%、30%和50%洗脫梯度對(duì)應(yīng)的洗脫峰無(wú)明顯區(qū)別(圖略),均為高純度的rhAT Ⅲ,所以沒必要把洗脫梯度分得過(guò)于精細(xì);直接用 0?50%?100%的洗脫梯度可以得到兩個(gè)洗脫峰 (圖 3),其中50%梯度對(duì)應(yīng)的洗脫峰P1純度達(dá)到電泳純 (圖4,泳道 5),該方法操作簡(jiǎn)單,短時(shí)間內(nèi)即可得到高純度的rhAT Ⅲ。

圖2 不同層析模式所得樣品的SDS-PAGE電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE analysis of rhAT Ⅲ eluted from different chromatography patterns. 1: marker; 2–4: P0, P1 and P2 of heparin affinity chromatography; 5: P1 of DEAE anion chromatography; 6:P1 of phenyl hydrophobic interaction chromatography.

圖3 肝素親和層析譜圖Fig. 3 Chromatogram of heparin affinity chromatography.

圖4 親和層析樣品的SDS-PAGE電泳圖Fig. 4 SDS-PAGE analysis of rhAT Ⅲ eluted from heparin affinity chromatography. 1: marker; 2: goat milk;3: supernatant of pH 7.2; 4: P0; 5: P1; 6: P2.

2.4.2 pH的影響

考察不同pH值 (pH 6.2、7.2、8.2)對(duì)rhAT Ⅲ分離純化的影響 (采用0?50%?100%洗脫梯度洗脫)。當(dāng)pH為6.2時(shí),目標(biāo)洗脫峰P1最大,但其雜質(zhì)含量也最高;當(dāng)pH為7.2和8.2時(shí),所得樣品的純度最高,無(wú)明顯雜質(zhì)。不同pH條件下目標(biāo)組分 (P1峰)中rhAT Ⅲ的活性收率分別為 20.6% (pH 6.2)、49.7%(pH 7.2)、13.9% (pH 8.2),說(shuō)明pH不僅影響溶液中rhAT Ⅲ的活性保持 (圖1),還對(duì)層析過(guò)程中rhAT Ⅲ的活性收率具有顯著影響。綜合考慮活性收率和純度,pH 7.2的條件最有利于rhAT Ⅲ的分離純化。

2.4.3 流速的影響

不同流速 (0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min)對(duì)層析效果的影響 (pH 7.2,采用0?50%?100%的梯度洗脫)如表2所示。流速太低 (0.5 mL/ min)時(shí),蛋白在柱上停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng),活性收率低;流速太高 (2.0 mL/min)時(shí),不利于蛋白的有效吸附,活性收率較低;1.0?1.5 mL/min的流速有利于提高蛋白的活性收率。綜合考慮蛋白收率和活性收率,選擇1.0 mL/min的操作流速。

2.4.4 上樣量的影響

從表3可以看出,1和2 mL料液/mL介質(zhì)的上樣量的效果基本相當(dāng);隨著上樣量的進(jìn)一步增加,rhAT Ⅲ的蛋白收率和活性收率都有下降趨勢(shì),這主要是因?yàn)樯蠘恿窟^(guò)高,超過(guò)了介質(zhì)載量,造成部分目標(biāo)蛋白穿透。綜合考慮處理速度、蛋白收率和活性收率,選擇2 mL料液/mL介質(zhì)的上樣量。

2.4.5 層析過(guò)程 (吸附-解吸)對(duì)蛋白活性的影響

將 50%梯度洗脫所得的 P1峰用平衡緩沖液透析后再次進(jìn)行Heparin親和層析。結(jié)果表明rhAT Ⅲ的蛋白收率達(dá)到95%以上,但活性收率只有68%,存在明顯的活性損失現(xiàn)象。熒光光譜分析結(jié)果表明,rhAT Ⅲ再次進(jìn)行肝素親和層析后,其最大吸收波長(zhǎng)從原來(lái)的338.6 nm降低到334.2 nm,發(fā)生了藍(lán)移。由此可見,層析過(guò)程中的吸附-解吸過(guò)程是造成rhAT Ⅲ結(jié)構(gòu)變化和活性收率低的主要原因。

表2 不同流速條件的rhAT Ⅲ收率Table 2 Recovery of rhAT Ⅲ with different flow rate

表3 不同上樣量的rhAT Ⅲ收率Table 3 Recovery of rhAT Ⅲ with different sample loaded

2.5 rhAT Ⅲ結(jié)構(gòu)分析

所純化的rhAT Ⅲ經(jīng)胰蛋白酶和DTT降解后,通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用分析其氨基酸序列,結(jié)果表明rhAT Ⅲ的氨基酸覆蓋率達(dá)到82.6% (與血漿來(lái)源的AT Ⅲ相比);二硫鍵定位結(jié)果表明rhAT Ⅲ中存在3個(gè)二硫鍵位置,分別是 Cys21-Cys95、Cys8-Cys128、Cys247-Cys430,與血漿來(lái)源的AT Ⅲ一致;糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果表明rhAT Ⅲ中存在4個(gè)糖基化位點(diǎn),分別為Asn96、Asn135、Asn155和Asn192,與血漿來(lái)源的AT Ⅲ一致[15-16]。上述分析結(jié)果表明所純化的rhAT Ⅲ的結(jié)構(gòu)與血漿來(lái)源的AT Ⅲ一致,結(jié)構(gòu)正確。

3 結(jié)論

本研究開發(fā)了一條基于等電點(diǎn)沉淀和肝素親和層析純化rhAT Ⅲ的工藝,重點(diǎn)考察了溶液條件和操作條件對(duì)rhAT Ⅲ蛋白收率和活性收率的影響,優(yōu)化了親和層析的操作條件 (pH 7.2、洗脫梯度為 0?50%?100%Buffer F、流速1.0 mL/min、上樣量2 mL料液/mL Heparin介質(zhì)),實(shí)現(xiàn)了rhAT Ⅲ的高效純化,純度達(dá)到99%以上,蛋白收率為 90%,活性收率約為 50%。與離子交換和疏水層析相比,肝素親和層析具有特異性強(qiáng)、分辨率高、產(chǎn)品回收率高的特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)液質(zhì)聯(lián)用、圓二色光譜、熒光光譜分析,所純化的rhAT Ⅲ與血漿來(lái)源AT Ⅲ結(jié)構(gòu)一致[16]。該工藝簡(jiǎn)化了rhAT Ⅲ分離純化的操作步驟,有利于工藝的進(jìn)一步放大和產(chǎn)品的規(guī)?;苽?。

[1]Morelli A. Production and clinical use of plasma antithrombin III//Bertolini J, Goss N, Curling J, Eds. Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use. New York: Wiley, 2012: 147.

[2]Mochizuki S, Miyano K, Kondo M, et al. Purification and characterization of recombinant human antithrombin containing the prelatent form in Chinese hamster ovary cells.Protein Expres Purif, 2005, 41: 323?331.

[3]Hoffman D. Purification and large-scale preparation of antithrombin Ⅲ. Am J Med, 1989, 87(3): S23?S26.

[4]Bu S, Wang HM, Sun T, et al. Expression and antiserum preparation of recombinant human antithrombin-Ⅲ. Chin J Cell Molr Immunol, 2013, 29(2): 174?177 (in Chinese).卜澍, 王洪梅, 孫濤, 等. 人抗凝血酶Ⅲ的表達(dá)及其抗血清的制備. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2013, 29(2): 174?177.

[5]Edmunds T, Van Patten SM, Pollock J, et al. Transgenically produced human antithrombin: structural and functional comparison to human plasma derived antithrombin. Blood,1998, 91(12): 4561?4571.

[6]Dai CY, Huang HJ. Progress of animal mammary gland bioreactor.Modern Agri Sci Technol, 2010, 4: 332?333 (in Chinese).代長(zhǎng)云, 黃海軍. 動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器研究進(jìn)展. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2010, 4: 332?333.

[7]Khodarovich YM, Goldman IL, Sadchikova ER, et al.Expression of eukaryotic recombinant proteins and deriving them from the milk of transgenic animals. Appl Biochem Micro, 2013, 49(9): 711?722.

[8]Niemann H, Kues WA. Transgenic farm animals: an update.Reprodu Fert Develop, 2007, 19(6): 762?770.

[9]Zou XG, Yuan SP, Xian J, et al. Large scale production of recombinant human antithrombin Ⅲ (rhAT Ⅲ)in transgenic cloned goats. Chin J Biotech, 2008, 24(1): 117?123 (in Chinese).鄒賢剛, 袁三平, 鮮建, 等. 轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊大量生產(chǎn)重組人的抗凝血酶III蛋白質(zhì) (rhAT Ⅲ). 生物工程學(xué)報(bào), 2008,24(1): 117?123.

[10]Zou XG, Zhao YL, Yan SP. A recombinant goat fetal fibroblast cell for the expression of antithrombin Ⅲ: Chinese Patent, 201210362487.9.鄒賢剛, 趙雅琳, 袁三平. 一種表達(dá)抗凝血酶Ⅲ的重組羊胎兒成纖維細(xì)胞: 中國(guó), 201210362487.9.

[11]Zhu HC. Guide to Protein Purification and Identification.Beijing: Science Press, 1999: 158?159 (in Chinese).朱厚礎(chǔ). 蛋白質(zhì)純化與鑒定實(shí)驗(yàn)指南. 北京: 科學(xué)出版社,1999: 158?159.

[12]Gong DY, Li ZP, Ling GX. Determination of anfithrombin Ⅲactivity by microassay of chromogenic tripeptide substmte and its clinical application. Jiangxi J Med Lab Sci, 2000, 18(4):200?202 (in Chinese).龔道元, 李子萍, 凌光鑫. 微量發(fā)色三肽底物法測(cè)定抗凝血酶 III活性及其臨床應(yīng)用. 江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn), 2000, 18(4):200?202.

[13]Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970,227(259): 680?685.

[14]Swain M, Ross NW. A silver stain protocol for proteins yielding high resolution and transparent background in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. Electrophoresis, 1995,l6(6): 948?951.

[15]Carrell R, Stein P, Fermi G, et al. Biological implications of a 3 structure of dimeric antithrombin. Structure, 1994, 2(4):257?270.

[16]Kong YJ, Zhang GF, Luo J, et al. Facile purification and characterization of recombinant human antithrombin III from transgenic goat milk. J Chem Technol Biotechnol, 2011,86(10): 1303?1309.

猜你喜歡
等電點(diǎn)抗凝血酶羊奶
真空結(jié)合加熱、冷凍濃縮羊奶理化品質(zhì)分析
肝硬化患者血漿纖維蛋白原、D-二聚體和抗凝血酶Ⅲ活性檢測(cè)及臨床意義
醫(yī)用羧甲基殼聚糖等電點(diǎn)的測(cè)定
氨基芳磺酸染料修飾蠶絲的電荷效應(yīng)研究
5款羊奶食譜讓你更美
茚三酮溶液檢驗(yàn)氨基酸實(shí)驗(yàn)的實(shí)證與優(yōu)化
血漿抗凝血酶Ⅲ和血清降鈣素原檢測(cè)在腹腔感染診斷和預(yù)后中的臨床價(jià)值
響應(yīng)面優(yōu)化等電點(diǎn)法破乳工藝
PCC中不同水平抗凝血酶和肝素對(duì)其促凝及抗凝能力的影響
賣羊奶的老人
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
404 Not Found

404 Not Found


nginx
海门市| 冷水江市| 南平市| 长泰县| 湘阴县| 梁山县| 汝南县| 鄂尔多斯市| 白山市| 微博| 中山市| 丽水市| 蓝田县| 双桥区| 磴口县| 平顶山市| 富顺县| 博湖县| 贵德县| 通榆县| 磴口县| 丰宁| 定边县| 汝阳县| 即墨市| 平度市| 焉耆| 内丘县| 阜新| 恩施市| 河北省| 醴陵市| 邯郸县| 兖州市| 孝义市| 乐业县| 东辽县| 邵武市| 大连市| 米泉市| 瑞丽市|