李繁，蔣巖，張桂云，蒲鑫，潘品良

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 性病艾滋病預(yù)防控制中心，北京 102206

自1997年《全國(guó)艾滋病檢測(cè)工作規(guī)范》實(shí)施以來(lái)，人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency vi?rus，HIV）抗體檢測(cè)作為HIV實(shí)驗(yàn)室診斷主要檢測(cè)手段的檢測(cè)策略已在我國(guó)實(shí)行了十幾年的時(shí)間。《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》2009年版規(guī)定，HIV抗體檢測(cè)分為篩查試驗(yàn)（最常用的為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，ELI?SA）和確證試驗(yàn)（蛋白印跡法，Western印跡）[1]。

HIV抗體檢測(cè)只適用于HIV感染窗口期后艾滋病患者整個(gè)病程中的艾滋病實(shí)驗(yàn)室診斷，不適用于HIV感染窗口期和HIV陽(yáng)性母親所生18個(gè)月以下嬰兒（由于母體抗體的干擾）。此外，受被檢測(cè)者自身免疫狀況、病程及感染其他疾病的影響，以及高敏感性的檢測(cè)方法和試劑等原因，抗體確證試驗(yàn)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)“抗體不確定”樣本[2]。此類(lèi)樣本須結(jié)合流行病學(xué)資料進(jìn)行3個(gè)月后的跟蹤隨訪，這給受檢者帶來(lái)巨大的精神壓力，也不利于HIV的提早治療和預(yù)防。

HIV-1核酸定量（HIV-1病毒載量）檢測(cè)方法直接檢測(cè)血液中HIV的RNA量，可早于Western印跡檢測(cè)出血漿中的病毒，已經(jīng)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。在此，我們擬綜合對(duì)比分析HIV-1核酸定量試驗(yàn)和Western印跡檢測(cè)結(jié)果，探討HIV-1核酸定量檢測(cè)用于HIV-1感染實(shí)驗(yàn)室診斷的可行性，分析此方法在實(shí)際應(yīng)用中的優(yōu)點(diǎn)和局限性。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選取參比室?guī)齑娴?45例第四代篩查試劑檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的血漿樣本。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 確證試驗(yàn)（Western印跡，以下簡(jiǎn)稱(chēng)WB）采用MP生物醫(yī)學(xué)公司HIV1+2型抗體檢測(cè)試劑盒（免疫印跡法，HIV BLOT2.2），儀器為Autoblot system 20免疫印跡儀。

1.2.2 HIV-1核酸定量檢測(cè)試驗(yàn)（病毒載量試驗(yàn)）采用Roche公司COBAS AmpliPrep/COBAS Taq?Man HIV-1 Test V2.0試劑盒，儀器為Roche公司Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan全自動(dòng)分析系統(tǒng)。

以上試驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照試劑盒和儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所有檢測(cè)試劑均在有效期內(nèi)。

1.3 WB判定標(biāo)準(zhǔn)

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)判定。HIV-1抗體陽(yáng)性要求至少檢出2條env帶（gp41和gp160/gp120）及gag帶（p55、p24、p17）或 pol帶（p66、p51、p31）；HIV抗體陰性是指無(wú)HIV抗體特異帶出現(xiàn)；HIV抗體不確定性是指出現(xiàn)HIV抗體特異帶，但不足以判定為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 HIV-1核酸定量檢測(cè)試驗(yàn)和WB檢測(cè)結(jié)果比較

對(duì)145例樣本分別進(jìn)行WB和HIV-1核酸定量檢測(cè)試驗(yàn)，WB檢出陽(yáng)性樣本120例，陰性8例，結(jié)果不確定17例；核酸定量試驗(yàn)檢出131例，結(jié)果為“TND”的14例。見(jiàn)表1。

2.2 病毒載量值的分布

131例HIV-1核酸定量試驗(yàn)檢出樣本中，69例病毒載量log10值為4～5，所占比例為52.7%；log10值為3～4的樣本36份，所占比例27.5%；log10值大于5的樣本18份，所占比例為13.8%；log10值小于3的樣本8份，所占比例為6.0%。見(jiàn)表2。

2.3 WB不確定樣本及HIV-1核酸定量試驗(yàn)和WB結(jié)果不一致樣本比較

表1 HIV-1核酸定量檢測(cè)試驗(yàn)和WB檢測(cè)結(jié)果比較

表2 HIV-1核酸定量檢測(cè)結(jié)果分布

HIV-1核酸定量試驗(yàn)檢出12例WB結(jié)果不確定樣本，2例WB陰性樣本；有3例WB結(jié)果為陽(yáng)性的樣本，HIV-1核酸定量試驗(yàn)結(jié)果為“TND”。見(jiàn)表3。

3 討論

多年來(lái)，由于體外HIV核酸擴(kuò)增試驗(yàn)操作步驟較復(fù)雜，受實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和操作者影響因素多，容易污染而導(dǎo)致假陽(yáng)性，HIV-1核酸定量檢測(cè)大多用來(lái)評(píng)估HIV感染進(jìn)程和監(jiān)測(cè)抗病毒療效，一般不作為診斷依據(jù)?！度珖?guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》（2009年修訂版）中規(guī)定HIV核酸檢測(cè)只能作為輔助診斷依據(jù)，確診仍然需要HIV抗體確證試驗(yàn)結(jié)果。隨著科技的發(fā)展，HIV-1核酸定量檢測(cè)技術(shù)有了很大的進(jìn)展，自動(dòng)化程度也日益提高，如Cobas AmpliPrep/Cobas Taq?Man全自動(dòng)分析系統(tǒng)，核酸擴(kuò)增和檢測(cè)程序全部在密閉的儀器中由機(jī)械臂進(jìn)行自動(dòng)化操作，完全代替了手工提取，大大降低了污染風(fēng)險(xiǎn)，使得檢測(cè)的精確度也大幅度提高。

從表1可看出，有117例樣本的WB和HIV-1核酸定量試驗(yàn)結(jié)果一致，均為陽(yáng)性。25例WB結(jié)果不確定和陰性樣本中，HIV-1核酸定量試驗(yàn)檢出14例，其中10例病毒載量值＞104拷貝/mL（表2、3），符合HIV急性/早期病毒免疫學(xué)特征，可以判斷為HIV急性/早期感染；其余4例病毒載量值為612～2360拷貝/mL（表3），低于通常在急性/早期感染所見(jiàn)到的高病毒載量。由于本實(shí)驗(yàn)使用的是實(shí)驗(yàn)室?guī)齑鏄颖荆鄙倥R床和隨訪資料，無(wú)法得知樣本來(lái)源者的真實(shí)感染狀態(tài)及病毒治療相關(guān)信息，所以無(wú)從驗(yàn)證HIV-1病毒載量對(duì)這幾例樣本的診斷結(jié)果。出現(xiàn)這種情況，可能是因?yàn)闃颖静杉贖IV感染病毒儲(chǔ)存庫(kù)建立初期，病毒載量值還處于較低水平；或者是由于樣本采集、保存和運(yùn)輸不當(dāng)?shù)仍蛟斐傻暮怂峤到猓灰膊荒芘懦菍?shí)驗(yàn)室誤操作、交叉污染等原因造成的假陽(yáng)性結(jié)果。國(guó)外文獻(xiàn)曾報(bào)道病毒載量值較低的假陽(yáng)性案例[3]，對(duì)于病毒載量值高于檢測(cè)限但小于5000拷貝/mL的樣本，通常視為可能存在假陽(yáng)性結(jié)果[4-5]，建議再采集一份血漿進(jìn)行HIV-1核酸定量檢測(cè)試驗(yàn)。

表3 WB不確定樣本及WB和病毒載量試驗(yàn)結(jié)果不符合樣本列表

有3例WB檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣本，病毒載量檢測(cè)結(jié)果為“TND”（表3）。這是由于HIV-1核酸定量方法本身有最低檢測(cè)限（如COBAS AmpliPrep/CO?BAS TaqMan HIV-1 Test V2.0試劑盒的檢測(cè)下限為20拷貝/mL），檢測(cè)結(jié)果為“TND”只能代表未檢出。曾經(jīng)有報(bào)道，有少數(shù)未經(jīng)治療且抗體檢測(cè)陽(yáng)性的感染者，血液中病毒含量長(zhǎng)期處于低水平狀態(tài)，HIV-1核酸檢測(cè)試驗(yàn)無(wú)法檢出[6-8]；檢測(cè)非B亞型時(shí)，HIV-1亞型變異導(dǎo)致的基因差異也可能出現(xiàn)檢測(cè)值被低估[9-12]的情況；此外，現(xiàn)有的HIV-1核酸定量檢測(cè)試劑無(wú)法檢測(cè)HIV-2的樣本。所以，對(duì)于HIV-1核酸定量檢測(cè)結(jié)果為“TND”的樣本，建議加做WB試驗(yàn)或結(jié)合其他補(bǔ)充試驗(yàn)結(jié)果來(lái)進(jìn)行綜合診斷。

人體感染HIV后，首先在血液中檢出的是HIV RNA和p24抗原，急性期感染者血漿中病毒RNA急劇復(fù)制，最高可達(dá)107拷貝/mL[13]，HIV-1急性期感染者的傳染性明顯高于情況已穩(wěn)定的感染者，有研究顯示大約50%以上的HIV傳播發(fā)生在HIV感染急性早期階段[14]，所以HIV-1核酸定量試驗(yàn)對(duì)于HIV急性/早期感染樣本的意義尤其重要。在本研究中，HIV-1核酸定量試驗(yàn)比傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷（WB）方法有更高的敏感性，可以檢出由于急性/早期感染等原因?qū)е耊B試驗(yàn)無(wú)法診斷的陽(yáng)性樣本，彌補(bǔ)傳統(tǒng)WB診斷試驗(yàn)的不足。

另外，HIV-1核酸定量試驗(yàn)對(duì)于樣本質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和操作者的要求較高，HIV-1核酸定量試驗(yàn)需要使用質(zhì)量較高的血漿，可能存在肝素的樣本，重度溶血、變質(zhì)、乳糜血、反復(fù)凍融樣本和由于溫度等原因造成的保存不當(dāng)?shù)葮颖静贿m合用HIV-1核酸定量試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。在日常工作中，也要求我們要加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控，杜絕實(shí)驗(yàn)室污染。

[1]中國(guó)疾病預(yù)防控制中心.全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范（2009年修訂版）[Z].2009.

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