俞恩光，鄭仁朝，鄭裕國

(浙江工業(yè)大學生物工程研究所，浙江 杭州 310014)

手性藥物的藥理作用是藥物小分子通過與體內大分子之間的嚴格手性匹配與分子識別而實現(xiàn)的。因此，服用消旋體藥物導致在攝入活性對映體的同時，攝取了大量無效甚至有毒有害的對映體。2006年美國FDA批準的小分子藥物中，80%是手性化合物，其中75%是手性化合物中的單個對映異構體。同年1月，我國SFDA也出臺了相應的政策法規(guī)［1］?？梢?，醫(yī)藥化工業(yè)對手性合成提出了越來越高的要求。由于生物催化具有優(yōu)異的化學、區(qū)域和立體選擇性，且反應條件溫和(中性、室溫)、介質環(huán)保、“三廢”排放少等諸多優(yōu)點，在有機合成特別是手性醫(yī)藥化學品的合成中受到越來越多的關注。生物催化劑(酶)對其天然底物通常具有較好的反應活性和立體選擇性，但對于非天然底物，其催化活性、穩(wěn)定性和選擇性卻難以盡如人意。而有機合成所用底物一般都是人工合成的非天然底物，這就要求開發(fā)提高生物催化劑反應活性、穩(wěn)定性和選擇性的方法。目前主要的方法有:①對生物催化劑進行分子改造［2-3］;②對非天然底物進行結構修飾［4］;③對生物催化劑進行預處理(凍干、印跡酶、固定化等)［5-6］;④添加表面活性劑、金屬離子或抑制劑［7-8］。但這些方法操作繁瑣，成本較高。溫度除了可以改變酶促反應的速度外，對酶催化反應的立體選擇性也有較大影響。與其他方法相比，溫度調控立體選擇性具有簡單、便捷等優(yōu)勢。

1 酶催化立體選擇性與反應溫度的關系:理論分析

酶的立體選擇性由對映體選擇率(enantiomeric ratio，E)表示，它是一個溫度依賴性常數(shù)［9］。下面從熱力學理論角度分析溫度對其選擇性影響的原因。

溫度對酶催化反應選擇性的影響是由于溫度變化范圍內熵和焓變化產(chǎn)生的差異引起的。根據(jù)對映體選擇率E的定義可知:

由于酶的立體選擇性是由2種對映體之間所存在的吉布斯自由能差異所產(chǎn)生的，故

同時，根據(jù)熱力學定理可得:

假設在某一溫度時，酶對消旋底物的2種構型單體選擇性相同，則E=1，ΔΔG+=0，此時，熵和焓對酶催化的作用相等。

整理得

Tr被定義為“消旋溫度”。這就意味著當反應溫度在Tr附近變化時，酶反應的選擇性就會發(fā)生反轉。當反應溫度小于Tr時，熵的貢獻很小，ΔΔG+主要是活化焓差異 ΔΔH+決定的，E值會隨溫度的升高而降低，直到T=Tr時，E=1。相反地，當反應溫度大于Tr時，ΔΔG+由 TΔΔS+主導，焓起很小的作用，E值隨溫度的升高而升高。

以lnE對1/T作圖可得酶催化反應的 ΔΔH+和 ΔΔS+。

式中參數(shù):

(1)ΔΔG+:反應自由能。分子間發(fā)生反應所需自由能;(2)ΔΔH+:反應的焓變。與反應自由能相關的溫度依賴性常數(shù)，是反應形成過渡態(tài)時產(chǎn)生的偶極和空間作用力相關;(3)ΔΔS+:反應的熵變。也是反應自由能相關的溫度依賴性常數(shù)，主要是由于反應形成過渡態(tài)時溶劑和反應介質所形成的阻礙作用。

2 反應溫度調控生物催化對映選擇性的應用

目前，通過溫度調節(jié)酶立體選擇性的實例越來越多，在醇脫氫酶、青霉素G酰化酶和脫鹵酶，特別在具有較廣溫度適應范圍(－40～120℃)的脂肪酶和酯酶［10-11］中報道較多。

2.1 反應溫度調節(jié)醇脫氫酶立體選擇性

Phillips等［12］利用 Thermoanaerobacter ethanolicu仲醇脫氫酶(SADH)催化外消旋2-丁醇、2-戊醇和2-己醇生成相應的手性醇中發(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高，酶的立體選擇性下降甚至發(fā)生逆轉。以2-丁醇為底物時，Tr=26℃。當T＜26℃時，(S)-2-丁醇是酶偏好的底物(lnE＜0)，而當T＞26℃時，(R)-2-丁醇是酶偏好的底物(lnE＞0)。即酶的立體選擇性發(fā)生了逆轉，由原來的S型選擇性變?yōu)镽型選擇性(圖1)。以2-戊醇為底物時，也觀察到同樣的變化過程，Tr=70℃。

圖1 醇脫氫酶不對稱拆分(R，S)-2-丁醇生成相應的手性醇Fig.1 Enantioselective resolution of(R，S)-2-butanol by SADH

2.2 反應溫度調控脂肪酶或酯酶的立體選擇性

酯酶和脂肪酶催化的反應類型多，且在不同類型的反應中均發(fā)現(xiàn)溫度對其立體選擇性影響較大。

2.2.1 溫度對脂肪酶催化的乙?；磻Ⅲw選擇性的調控 Amir等［13］在利用固定化 Candida antarctita脂肪酶立體選擇性乙酰化3-(羥甲基)-1，4-苯并二氮雜卓-2-(酮)中發(fā)現(xiàn):當溫度由40℃降至－15℃時，酶對3-(羥甲基)-1-甲基-4-苯并二氮雜卓-2-(酮)的立體選擇性提升至原來的5倍;而對 3，3-二羥甲基-1，4-苯并二氮雜卓-2-(酮)，產(chǎn)物ee值由0℃時的90%下降為60℃的69%。Tomoko等［14］利用脂肪酶在超臨界二氧化碳和乙酸乙烯酯中立體選擇性乙?；庀?-(p-氯苯)-2，2，2-三氟乙醇中發(fā)現(xiàn)，該脂肪酶的 E值由低溫低壓的60下降到高溫高壓的10左右。

2.2.2 溫度對脂肪酶催化的氨解反應立體選擇性的調控 Paloma等［15］利用 CALB、Thermomyces lanuginosus脂肪酶(TLL)和 Pseudomonas alcaligenes脂肪酶(PAL)分別催化苯基甘氨酸甲酯、苯基丙氨酸甲酯的氨解反應發(fā)現(xiàn)(圖2)，CALB對苯基甘氨酸甲酯的E值隨反應溫度由40℃降低到－20℃時從17提高到52，而對苯基丙氨酸甲酯的E值變化不大。TLL和PAL對苯基丙氨酸甲酯的E值隨溫度由40℃下降到－20℃時，由13提高到84。

圖2 脂肪酶催化苯基甘氨酸甲酯/苯基丙氨酸甲酯的氨解反應Fig.2 Ammoniolysis of the methyl esters of phenylglycine/phenylalanine by lipase

2.2.3 溫度對脂肪酶或酯酶催化的酯化反應立體選擇性的調控 ①當T＜Tr時，溫度升高酶立體選擇性降低，溫度降低酶立體選擇性增加:Yoshitaka等［16］利用來自Candida rugosa脂肪酶MY在丁醇和異丙醚中催化2-苯基丙酸衍生物(圖3)酯化生成相應的酯類。圖3中1、2隨著溫度的升高，酶的E值下降到1(57℃)左右，此時，酶無選擇性。Takashi等［17］利用Burkholderia cepacia 脂肪酶拆分環(huán)氮乙烷-2-甲醇(圖4)。當溫度降低至－40℃時，酶的E值由17提高到符合工業(yè)化要求的99，將脂肪酶固定化到多孔陶瓷上后，酶催化反應速度提高了80倍，這為低溫生物催化的工業(yè)化應用提供了可能。②當T＞Tr時，溫度升高酶立體選擇性增加，溫度降低酶立體選擇性降低:Robert等［18］利用Candida rugosa(CRL)酯酶、Rhizomucor miehei(Palatase?)酯酶和極端嗜熱菌Sulfolobus solfataricus P1羧酸酯酶Sso EST1催化萘普生甲酯的水解(圖5)。CRL酯酶和Palatase?酯酶對萘普生甲酯的消旋溫度(Tr)分別為(－46.3±8.9)、(1.1±0.4)℃，溫度從0℃升高到60℃時，lnE分別從3提高到5，0提高到1(表1)。羧酸酯酶Sso EST1的Tr為(88.1±6.9)℃，當溫度由0℃升高到70℃時，lnE由3降低為1。這是由于羧酸酯酶Sso EST1催化過程主要是由焓控制的，而CRL酯酶和Palatase?酯酶則是由反應的熵控制的。

圖3 脂肪酶MY催化2-苯基丙酸衍生物的酯化反應Fig.3 Lipase MY catalyzed esterification of 2-phenoxypropionic acids

圖4 脂肪酶拆分環(huán)氮乙烷-2-甲醇Fig.4 Lipase-catalyzed resolution of azirine-2-methanol

圖5 酯酶催化(R，S)-萘普生甲酯的水解Fig.5 Esterase-Catalyzed Hydrolysis of(R，S)-Naproxen Methyl Ester

表1 酯酶催化(R，S)-萘普生甲酯的水解反應中的熱力學參數(shù)和消旋溫度Table 1 Thermodynamic parameter and Trof hydrolysis of(R，S)-Naproxen Methyl Ester catalyzed by Esterase

2.3 反應溫度調控其他酶的立體選擇性

2.3.1 青霉素 G ?；?Gianfranco等［19］利用青霉素G?；竸恿W拆分β-內酰胺(圖6)，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，酶的E值下降至24(T=301 K)，溫度繼續(xù)升高，酶的E值又上升至130(T=328 K)。通過對溫度的簡單調節(jié)，可以使原本不適用的酶變得非常有效。

圖6 青霉素G?；竸恿W拆分β-內酰胺Fig.6 Kinetic resolution of racemic β-lactam 1 by PGA(Penicillin G-Acylase)

2.3.2 脫鹵酶 Radka等［20］利用 Bradyrhizobium japonicum USDA110鹵代烷脫鹵酶DbjA研究溫度對酶立體選擇性的影響。該酶催化不同底物的E值和熵焓變化見表2。研究發(fā)現(xiàn)，降低溫度可顯著提高該酶的選擇性。對2-溴戊烷，溫度由50℃降低至20℃時，E值由13提高至174;對乙基-2-溴丙酸鹽，由197提高至474;對底物甲基-2-溴丁酸鹽，由83提高至225。

表2 脫鹵酶DbjA催化鹵化物脫鹵反應E值和熵焓變Table 2 Thermodynamic parameter and Trof dehalo-reaction catalyzed by DbjA

3 結語

綜上所述，溫度對脂肪酶、酯酶、脫鹵酶、醇脫氫酶和青霉素G酰化酶的立體選擇性有較大影響。一般來說，當反應溫度高于Tr時，提高溫度會降低酶催化的立體選擇性，但當溫度小于Tr時，提高溫度可以提高酶的立體選擇性。當反應的Tr很低時，可以通過添加有機溶劑調高酶的Tr，從而可以在室溫條件下調節(jié)酶的選擇性。當在室溫條件下E值很低時，可降低反應溫度來提高E值，從而達到工業(yè)化應用的要求。因此，溫度調節(jié)將在酶立體選擇性調控中發(fā)揮重要作用。

［1］朱敦明，吳洽慶.生物催化劑立體選擇性的基因工程改造［J］.生物工程學報，2009，25(12):1770-1778.

［2］Terao Y，Ijima Y，Miyamoto K.Inversion of enantioselectivity of arylmalonate decarboxylase via site-directed mutation based on the proposed reaction mechanism［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2007，45:15-20.

［3］Ijima Y，Matoishi K，Terao Y.Inversion of enantioselectivity of asymmetric biocatalytic decarboxylation by site-directed mutagenesis based on the reaction mechanism［J］.Chemical Communications，2005，7:877-899.

［4］Arto L，Hanna MK，Petri T.Chemoenzymatic approach to enantiopure piperidine based beta amino esters in organic solvents［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2007，18(2):181-191.

［5］Asha C，Rajinder P，Surrinder K.Arthrobacter sp.lipase immobilization for improvement in stability and enantioselectivity［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2006，73(3):598-606.

［6］Jin CW，Vicknesh S，Hui HT.Immobilization of Candida rugosa lipase by cross linking with glutaraldehyde followed by entrapment in alginate beads［J］.Biocatalysis and Biotransformation，2006，24(5):352-357.

［7］Kwang WL，Hyun AB，Gab SS.Purification and catalytic properties of novel enantioselective lipase from Acinetobacter sp.ES-1 for hydrolysis of(S)-ketoprofen ethyl ester［J］.Enzyme and Microbial Technology，2006，38(3):443-448.

［8］Zhang DL，Jian HX，Li LZ.Overexpression of Serratia marcescens lipase in Escherichia coli for efficient bioresolution of racemic ketoprofen［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2007，47(3):105-110.

［9］Phillips RS.Temperature modulation of the stereochemistry of enzymatic catalysis:prospects for exploitation［J］.Trends Biotechnol，1996，14:13-16.

［10］Sakai T.The effect of temperature on the lipase-catalyzed asymmetric protonation of 1-acetoxy-2-methylcyclohexene giving(R)-2-methylcyclohexanone［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2004，15(18):2749-2756.

［11］Tadashi E，Masafumi K，Toshinobu K，et al.Highly enantioselective lipase-catalyzed reactions at high temperatures up to 120 ℃ in organic solvent［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2003，14:3943-3947.

［12］Pham VT，Phillips RS，Ljungdahl LG.Temperature-dependent enantiospecificity of secondary alcohol dehydrogenase from Thermoanaerobacter ethanolicus［J］.Journal of American Chemical Society，1989，111:1935-1936.

［13］Amir A，Andreja L，Zsuzsa M，et al.Lipase catalyzed acetylation of 3-substituted 2，3-dihydro-lH-1，4-benzodiazepin-2-ones:Effect of temperature and conformation on enantioselectivity and configuration［J］.Hflvetica Chimica Acta，1998，81:1567-1582.

［14］Tomoko M.Control of enantioselectivity of lipase-catalyzed esterification in supercritical carbon dioxide by tuning the pressure and temperature［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2003，14:2087-2091.

［15］Paloma LS，Margreth A，Wegman，et al.Enantioselective enzyme catalysed ammoniolysis of amino acid derivatives:Effect of temperature［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2001，12:235-240.

［16］Yoshitaka Y，Shin IU.High temperature-induced high enantioselectivity of lipase for esterifications of 2-Phenoxypropionic acids in organic solvent［J］.Bioorganic Chemistry，1997，25:88-99.

［17］Takashi S.Low-temperature method for a dramatic improvement in enantioselectivity in lipase-catalyzed reactions［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2004，15:2749-2756.

［18］Robert MK.Enantiomeric resolution of 2-aryl propionic esters with hyperthermophilic and mesophilic esterases:Contrasting thermodynamic mechanisms［J］.Journal of American Chemical Society，2002，124:8190-8191.

［19］Gianfranco C，Valeria DM，Paola G，et al.Temperature and solvent effects on enzyme stereoselectivity:inversion temperature in kinetic resolutions with lipases［J］.Chemical.Communications，2000:2351-2352.

［20］Radka C，Zbynek P，Yukari S，et al.Stereoselectivity and conformational stability of haloalkane dehalogenase DbjA from Bradyrhizobium japonicum USDA110:the effect of pH and temperature［J］.Journal of Federation European Biochemical Societies，2011，278:2728-2738.