廖靈旋，于 昊，黃建忠

(福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心生命科學(xué)學(xué)院福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，福建 福州 350108)

多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是指含有2個(gè)或者2個(gè)以上雙鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸，碳原子數(shù)目一般為18～22個(gè)。主要包括α-亞麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、亞油酸(LA)、二高-γ-亞麻酸(DHGLA)、花生四烯酸(ARA)等［1-2］。其中，根據(jù)距離甲基端第1個(gè)雙鍵位置不同可以將多不飽和脂肪酸分為 ω-3、ω-6、ω-7、ω-9 等系列(也可以用n表示)［3］。主要的多不飽和脂肪酸如表1所示，這些多不飽和脂肪酸對(duì)于維持和調(diào)節(jié)人類健康起著至關(guān)重要的作用，是人類必需的脂肪酸(EFA)［4］。本文主要對(duì)多不飽和脂肪酸的微生物來(lái)源、作用機(jī)理、生物合成及新發(fā)現(xiàn)的聚酮合酶途徑等方面做一簡(jiǎn)述。

1 多不飽和脂肪酸的微生物來(lái)源

多不飽和脂肪酸對(duì)于維護(hù)人體健康是非常重要的，但由于哺乳動(dòng)物缺少合成長(zhǎng)鏈PUFAs關(guān)鍵酶基因，因此，只能通過(guò)外在的飲食來(lái)獲取。目前，在飲食方面PUFAs主要來(lái)自海洋魚(yú)類和植物種子油。由于市場(chǎng)對(duì)PUFAs的需求，從各種微生物中尋找PUFAs的來(lái)源成為研究熱點(diǎn)，主要的微生物有細(xì)菌、真菌、和藻類。

經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，真菌和藻類產(chǎn)不飽和脂肪酸明顯高于細(xì)菌。對(duì)于真菌，產(chǎn)不飽和脂肪酸主要有高山被孢霉、長(zhǎng)被孢霉、水霉、輪枝霉、樟疫霉、毛霉、小克銀漢霉等［5-6］。在海洋魚(yú)類中雖然有多不飽和脂肪酸，但其真正來(lái)源是食物，而非自產(chǎn)，海洋中的微生物才是多不飽和脂肪酸真正的生產(chǎn)者［7］。目前已經(jīng)從海洋中分離到一些富含DHA和EPA的微生物，其中，藻類中的金藻綱、黃藻綱、綠藻綱和隱藻綱富含EPA，而DHA主要集中在甲藻、金藻和硅藻中?，F(xiàn)在用于商業(yè)生產(chǎn)DHA的海洋微生物主要是裂殖壺菌［8-9］和隱甲藻［10］。

表1 主要的多不飽和脂肪酸Table 1 Typical PUFAs

2 多不飽和脂肪酸的作用機(jī)理

多不飽和脂肪酸是人類必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，必須通過(guò)食物獲得。對(duì)這些多不飽和脂肪酸的深入研究發(fā)現(xiàn)，它們具有很多重要的生理功能，如降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)、提高免疫、抗癌等。因其對(duì)人體健康的有利影響，從而引起人們很大的關(guān)注［11-12］。

2.1 細(xì)胞膜的組成部分

多不飽和脂肪酸是大多數(shù)真核生物細(xì)胞膜磷脂的關(guān)鍵組成成分，在細(xì)胞表面信號(hào)傳遞上起到至關(guān)重要的作用［13］。其中，ω-3多不飽和脂肪酸中的DHA在大腦和視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞膜上含量非常豐富。在大腦的組織細(xì)胞中，DHA的含量可達(dá)到細(xì)胞總脂的10%;在視網(wǎng)膜的細(xì)胞中，DHA的含量可達(dá)到細(xì)胞總脂的60%以上［14］。所以，多不飽和脂肪酸對(duì)于人體腦神經(jīng)及視覺(jué)有重要作用。

2.2 影響細(xì)胞膜流動(dòng)性

細(xì)胞膜的流動(dòng)性是由于構(gòu)成膜之間的磷脂雙分子和蛋白質(zhì)分子不斷處于橫向或縱向的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。對(duì)于細(xì)胞代謝來(lái)說(shuō)，有著非常重要的作用，如物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞分化、細(xì)胞融合與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等都與細(xì)胞膜的流動(dòng)性有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，多不飽和脂肪酸對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響，是由于其插入膜脂質(zhì)雙分子層中，最終來(lái)影響膜的結(jié)構(gòu)［15］。

在一些研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)用多不飽和脂肪酸(DHA、EPA)來(lái)培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞，能夠增加膜的流動(dòng)性，并呈劑量反應(yīng)，是由于顯著地改變了細(xì)胞膜磷脂構(gòu)成，從而提高了細(xì)胞膜的流動(dòng)性［16］。另外，在對(duì)乳腺癌細(xì)胞膜研究中，發(fā)現(xiàn)多不飽和脂肪酸的不同構(gòu)成比例對(duì)其也有影響［17］，這也是由于相關(guān)膜蛋白活性跟膜功能受到影響而導(dǎo)致的［18-19］。

2.3 調(diào)節(jié)膜離子通道

早在20世紀(jì)80年代，人們發(fā)現(xiàn)格陵蘭愛(ài)斯基摩人由于食用富含多不飽和脂肪酸的魚(yú)類食物，患心血管疾病的人較少［20-21］，從而使多不飽和脂肪酸受到高度重視。經(jīng)過(guò)眾多的研究發(fā)現(xiàn)，多不飽和脂肪酸是通過(guò)調(diào)節(jié)膜上離子通道來(lái)降低心律失常。研究顯示，不飽和脂肪酸能夠抑制心肌細(xì)胞膜上的鈉離子通道，通過(guò)抑制鈉離子電流，使動(dòng)作電位縮短，減少異常興奮的產(chǎn)生，降低心率［22］。另外，多不飽和脂肪酸還能夠穩(wěn)定細(xì)胞膜上鈣離子通道，通過(guò)阻斷電壓門控鈣離子流，從而使鈣離子濃度降低［23］。

2.4 免疫調(diào)節(jié)作用

多不飽和脂肪酸對(duì)于人體的免疫細(xì)胞也具有調(diào)節(jié)作用，由于多不飽和脂肪酸不僅是人體必需的脂肪酸，也是細(xì)胞膜成分磷脂的組成部分。多不飽和脂肪酸的攝入，可以明顯改變免疫細(xì)胞T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、K淋巴細(xì)胞和NK淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜組成，從而影響這些細(xì)胞受體的空間構(gòu)象、功能以及與外在因子的結(jié)合能力，最終起到對(duì)細(xì)胞免疫作用的影響［24］。一些研究表明，通過(guò)給小鼠飼喂適量多不飽和脂肪酸DHA、EPA，可以改變第二信使的產(chǎn)生，從而影響淋巴細(xì)胞的功能，明顯抑制了T細(xì)胞分泌IL-2［25-26］。

2.5 影響基因表達(dá)

多不飽和脂肪酸除了是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還對(duì)機(jī)體的某些基因起著調(diào)控作用。近年來(lái)經(jīng)過(guò)研究表明［27］，多不飽和脂肪酸參與一些基因的表達(dá)調(diào)控主要是通過(guò)與核受體和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來(lái)發(fā)揮其功能，特別是對(duì)脂肪代謝中酶和蛋白基因的調(diào)控［28］。研究中還發(fā)現(xiàn)，不同種類的脂肪酸對(duì)這些代謝基因都具有調(diào)節(jié)作用［29-30］，其中以多不飽和脂肪酸最為顯著［31］。

3 微生物產(chǎn)多不飽和脂肪酸的生物合成途徑

在真核微生物如真菌和藻類中，已知的多數(shù)多不飽和脂肪酸是通過(guò)脂肪酸延長(zhǎng)酶和去飽和酶在線粒體或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)而獲得的［32-33］。在生物體內(nèi)形成多不飽和脂肪酸是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，它是以飽和脂肪酸硬脂酸(18∶0)為底物，通過(guò)脂肪酸延長(zhǎng)酶與去飽和酶作用完成的。其中碳鏈的延長(zhǎng)與去飽和作用是交替進(jìn)行的，最終經(jīng)過(guò)一系列的脫氫和碳鏈延長(zhǎng)而形成。如，已知DHA的生物合成是從乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A開(kāi)始經(jīng)過(guò)縮合、還原、脫水、還原等，接近30個(gè)不同的酶反應(yīng)和70個(gè)包括4個(gè)重復(fù)的脂肪酸循環(huán)反應(yīng)最終形成。其中在合成途徑中，去飽和酶是關(guān)鍵酶，它控制著不飽和脂肪酸的不飽和程度，合成途徑如圖1所示［34］。

圖1 多不飽和脂肪酸在生物體的合成途徑Fig.1 biosynthetic pathway of PUFAs

然而，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，在某些深海中的一些海洋微生物不需要通過(guò)脂肪酸延長(zhǎng)酶和脂肪酸去飽和酶來(lái)形成PUFAs，其合成PUFAs的途徑是通過(guò)聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)來(lái)催化的，這一條新穎代謝途徑的發(fā)現(xiàn)，為轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)新的不飽和脂肪酸提供了希望［35］。近年來(lái)，一些研究小組在海洋中發(fā)現(xiàn)一些富含不飽和長(zhǎng)鏈DHA和EPA的微生物，如產(chǎn)DHA的海產(chǎn)弧菌(Vibrio marinus MP-1)、產(chǎn) EPA的希瓦氏菌(Shewanella sp.)等［36］。最早報(bào)道能產(chǎn) PUFAs的是腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens SCRC2378)，通過(guò)構(gòu)建該菌株的基因組文庫(kù)，研究設(shè)計(jì)從中獲得1段38 kb DNA，對(duì)其所包含的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)開(kāi)放閱讀框 (Open reading frame，ORF)與脂肪酸合成酶具有同源性［37］。對(duì)這些ORF進(jìn)行序列比對(duì)分析并導(dǎo)入大腸埃希菌進(jìn)行異源表達(dá)，在不依賴大腸脂肪酸合酶 (Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)和任何長(zhǎng)鏈中間物質(zhì)的情況下，發(fā)現(xiàn)能夠獲得二十二碳五烯酸 (22∶5)從而也證實(shí)了這5個(gè)ORF能夠完全獨(dú)立的催化形成PUFAs。另外，通過(guò)構(gòu)建pEPA質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到不具合成多不飽和脂肪酸能力的大腸埃希菌中，在厭氧條件下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)仍能合成EPA，說(shuō)明該EPA的合成與之前的合成途徑不同，不涉及有氧脫氫機(jī)制。此外，在陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的一些產(chǎn)多不飽和脂肪酸的海洋細(xì)菌中，也有與產(chǎn)EPA類似的基因簇，所以通過(guò)這些研究可以表明這些海洋細(xì)菌合成多不飽和脂肪酸不涉及脂肪酸的脫氫和延長(zhǎng)，而是由聚酮合酶來(lái)催化產(chǎn)生的。

圖2 假設(shè)希瓦氏菌聚酮合酶合成多不飽和脂肪酸代謝途徑Fig.2 Hypothetical pathway for PUFAs synthesis by the Shewanella polyketide synthase

雖然確切的催化機(jī)制尚未闡明，但 Jim Metz［35］等經(jīng)過(guò)對(duì)基因簇的比對(duì)分析，提出了PUFA在腐敗希瓦氏菌的合成途徑，如圖2所示［38］。它是在PKS合成酶的作用下，以乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A為底物，經(jīng)過(guò)縮合、還原、脫水、還原/異構(gòu)化循環(huán)反應(yīng)，最終形成多不飽和脂肪酸。在這個(gè)合成途徑中，PKS合成酶與脂肪酸合酶執(zhí)行了一些相同的反應(yīng)，用了相同的小蛋白，?；d體蛋白(ACP)［39］，作為一個(gè)共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)延長(zhǎng)碳鏈。不同的是PKS途徑過(guò)程不像傳統(tǒng)的途徑需要氧去飽和引入雙鍵，因?yàn)樵赑KS合成酶中存在脫水酶和異構(gòu)酶，可以直接形成雙鍵，因此也稱為厭氧聚酮合酶途徑。對(duì)于聚酮合酶合成不飽和脂肪酸，盡管確切的生物合成機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明，但其關(guān)鍵步驟主要有縮合和異構(gòu)化。其中，參與反應(yīng)的酶有3-酮基合成酶、3-酮脂酰還原酶、烯醇還原酶、脫水酶及異構(gòu)酶等，在合成途徑中酮基合成酶起著關(guān)鍵酶的作用，催化很多底物的縮合反應(yīng)。

4 聚酮合酶合成不飽和脂肪酸中的關(guān)鍵基因及功能

4.1 PKS途徑中關(guān)鍵基因的克隆

1996 年，Yazawa［37］從海洋細(xì)菌腐敗希瓦氏菌(S.putrefaciens SCRC2378)中克隆到合成EPA的基因簇，片段大小為38 kb，將該目的片段導(dǎo)入大腸埃希菌中做異源表達(dá)［40］，在發(fā)酵液中能夠檢測(cè)到EPA。因此，對(duì)克隆到的基因簇進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其共包含了8個(gè)ORF，但其中合成EPA所必需的只有5個(gè) ORF，總長(zhǎng)約 20 kb，分別被命名為pfaA、pfaB、pfaC、pfaD 和 pfaE［41］。另外，通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這5個(gè)DRF共包含11個(gè)酶，其中8個(gè)與PKS基因相關(guān)，另外3個(gè)與細(xì)菌脂肪酸合成酶蛋白具有同源性［35］。

1999年，Tanaka等在 DHA生產(chǎn)菌株 V.strain MP-1克隆到一段40 kb的目的片段，包括pfaA、pfaB、pfaC、pfaD。發(fā)現(xiàn)這 4 個(gè) ORF 與 EPA生物合成基因簇有很高的同源性［42-43］。另外，Gentile等在1株嗜冷菌希瓦氏菌(Shewanella sp.GA-22)中發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)亞油酸、花生四烯酸和EPA三種不同的多不飽和脂肪酸，通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物，只克隆到2個(gè)片段pfaA和pfaC［36］，并沒(méi)有克隆到已報(bào)道的5個(gè)pfa，可能是由于其他3個(gè)基因與已經(jīng)報(bào)道的基因同源性不高而致。

4.2 PKS途徑中關(guān)鍵基因的功能

近來(lái)，越來(lái)越多的海洋微生物基因組被測(cè)序，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)多不飽和脂肪酸的細(xì)菌都含有類似pfa基因序列，可以確定PKS途徑形成多不飽和脂肪酸是由于pfa基因簇作用而產(chǎn)生的。對(duì)已經(jīng)克隆報(bào)道過(guò)的pfa基因簇進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)結(jié)構(gòu)域跟PKS相關(guān)。而另外3個(gè)與細(xì)菌FAS蛋白同源，其中1個(gè)同肺炎雙球菌烯醇還原酶(ER)同源，2個(gè)與大腸埃希菌中編碼反式-癸烯酰-ACP 和其異構(gòu)化順式-3-癸烯酰-ACP［44］合成的FabA 脫水酶(DH)同源，如表2 所示［35］。

表2 pfa基因序列功能推測(cè)Table 2 The sequence of pfa gene function prediction

通過(guò)對(duì)聚酮合酶合成多不飽和脂肪酸中關(guān)鍵基因的克隆，發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)PUFAs的海洋細(xì)菌都含有類似pfa基因序列，且具有不同的排列方式，大致可分為3種類型，第1種是菌中含有完整的pfaA、pfaB、pfaC、pfaD 和 pfaE 五個(gè)關(guān)鍵基因，并且這些基因在同一個(gè)基因簇上;第2種，也含有完整的pfa基因序列，但是其中的pfaE基因與其他基因不在同一基因簇上;第3種，只包含pfaA、pfaB、pfaC、pfaD四個(gè)基因，pfaE基因則被整合到pfaC中。雖然這3種排列方式大致相同，但某些結(jié)構(gòu)域仍有不同之處，執(zhí)行不同的功能，最終導(dǎo)致生成不同的多不飽和脂肪酸。此外，對(duì)這些新基因的克隆及功能分析推測(cè)有利于科學(xué)家對(duì)聚酮合酶合成多不飽和脂肪酸路線有一個(gè)清晰的了解，對(duì)今后生物改造海洋細(xì)菌來(lái)解決PUFAs供應(yīng)問(wèn)題具有深遠(yuǎn)的意義。

5 小結(jié)和展望

近年來(lái)隨著一些研究機(jī)構(gòu)對(duì)PUFAs的深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有預(yù)防心血管疾病、高血壓及抗癌作用，導(dǎo)致市場(chǎng)上對(duì)于PUFAs的需求大幅度增加，因此需要不斷提高PUFAs的產(chǎn)量及質(zhì)量來(lái)滿足需求。對(duì)海洋微生物聚酮合酶合成多不飽和脂肪酸的研究，有利于從海洋微生物中生產(chǎn)獲得PUFAs，以此來(lái)解決市場(chǎng)需求問(wèn)題。目前，主要通過(guò)研究培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件的優(yōu)化以及高產(chǎn)菌株的選育來(lái)提高PUFAs的產(chǎn)量，但效果并不明顯。因此，研究通過(guò)其他途徑提高PUFAs的產(chǎn)量有重要的理論意義。隨著研究的不斷深入，通過(guò)基因工程手段生產(chǎn)PUFAs成為可能，且具有潛在的重要商業(yè)價(jià)值。目前發(fā)現(xiàn)的這些產(chǎn)多不飽和脂肪酸的菌大多來(lái)自深海，生存溫度很低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。因此，構(gòu)建適合工業(yè)應(yīng)用的基因工程菌株生產(chǎn)PUFAs成為研發(fā)的熱點(diǎn)［45-46］，這需要對(duì)生物合成基因簇的克隆，研究PUFAs途徑中的關(guān)鍵酶基因，在分子水平上進(jìn)行調(diào)控和表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)不飽和脂肪酸的高表達(dá)。目前對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的聚酮合酶合成多不飽和脂肪酸這一新穎途徑的具體分子合成機(jī)制和調(diào)控機(jī)制還沒(méi)有完全闡明，有待于以后的深入研究。

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