李 巖，呂昌龍，桑力軒，吳素琴，王美惠，楊芳莉，孫 遜，王大南*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110001;2.遼寧衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院免疫與微生物教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110101;3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

大蒜素具有抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病、抗衰老、抗微生物、抗?jié)?、提高機(jī)體免疫力等多種藥理作用［1-2］。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，大蒜素對(duì)多種微生物及寄生蟲(chóng)有強(qiáng)大的抑制和殺滅作用，被稱為植物廣譜抗菌素。大蒜素抗菌譜廣，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌、葡球菌、鏈球菌、克雷白桿菌、變形菌、梭狀桿菌均有明顯抑制作用［3］。黑大蒜是一種新型大蒜加工產(chǎn)品，由新鮮大蒜經(jīng)過(guò)一定的溫度和濕度處理而制成，與新鮮大蒜相比，其S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine，SAC)含量明顯升高，且無(wú)刺激性氣味，可直接食用。佐佐木的研究表明黑大蒜除具有明顯的抗氧化和抗腫瘤作用外，也具有抗細(xì)菌和抗真菌作用［4］。本文就黑大蒜提取物與抗生素聯(lián)合應(yīng)用是否可降低抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌抗菌作用的使用量進(jìn)行了體外研究，獲得如下結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌ATCC 25923，大腸埃希菌ATCC 25922購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.1.2 藥品 頭孢唑林標(biāo)準(zhǔn)品(Cefazolin，200 mg/支，中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度:99.3%，批號(hào):0421-9603);慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品(Gentamicin，200 mg/支，中國(guó)食品藥品檢定研究所，純度:95.1%，批號(hào):130326-201015);黑大蒜由日本弘前大學(xué)佐佐木甚一教授提供。

1.1.3 培養(yǎng)基與儀器 MH肉湯、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、普通營(yíng)養(yǎng)肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司);比濁儀(法國(guó)生物梅里埃公司);連續(xù)微量加樣器(美國(guó)Eppendorf公司);八導(dǎo)微量加樣器(美國(guó)Eppendorf公司);96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌液配制 從已分純的待檢細(xì)菌平板上挑取4～5個(gè)菌落，接種于3～5 mL MH肉湯培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)6 h。菌液用MH肉湯混勻后經(jīng)比濁儀校正濁度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，再用MH肉湯稀釋至1.5×105cfu/mL備用。

1.2.2 抗菌藥物儲(chǔ)備液配制 頭孢唑林用pH 6.0、0.1 mol/L的PBS緩沖液配制成終濃度為2048 mg/L的儲(chǔ)備液，并稀釋成1000 μg/mL的工作液;慶大霉素用蒸餾水配制成終濃度為2048 mg/L的儲(chǔ)備液，并稀釋成1000 μg/mL的工作液。以上藥物經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)除菌后備用。

1.2.3 黑大蒜提取物溶液配制 將100 g黑大蒜搗碎后，置1.5 L去離子水中煮沸2 h，待冷卻后8000 r/min，4℃離心30 min，取上清液再次離心，將上清液轉(zhuǎn)移至凍干瓶中，用真空冷凍干燥機(jī)制備干粉。將干粉用蒸餾水配制成1000 μg/mL的工作液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)除菌后備用。

1.2.4 液體稀釋法 參照2009年CLSI推薦的液體稀釋法進(jìn)行抗菌藥物敏感試驗(yàn)。將各抗菌藥物原液(1000 μg/mL)5.12 mL 加入 4.88 mL MH 肉湯中，混勻。吸出并分別加入第1管和第2管，每管1 mL，第2管經(jīng)混合后吸出1 mL加入第3管，依次類(lèi)推至第15管后，吸出1 mL棄去，即各管最終的藥物含量依次為 512、256、…、0.03 μg/mL。另設(shè)MH肉湯培養(yǎng)基對(duì)照和待測(cè)菌生長(zhǎng)對(duì)照。接下來(lái)，將已校正濃度的菌液依次加入各管中，每管0.05 mL，混勻，于37℃培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。

1.2.5 液體稀釋法藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)果參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)中液體稀釋法的判定標(biāo)準(zhǔn)，肉眼未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度即為該待測(cè)菌最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.6 黑大蒜提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌時(shí)間-殺菌曲線的測(cè)定 取培養(yǎng)18 h的細(xì)菌分別接種于5 mL含不同濃度黑大蒜提取物的MH肉湯中，使細(xì)菌終濃度為1.5×105cfu/mL。黑大蒜提取物濃度分別為 MIC/4、MIC/2、MIC、4MIC。細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)照管加入相應(yīng)體積的MH肉湯，空白對(duì)照管加入黑大蒜提取物但不加細(xì)菌。于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)(120 r/min)，分別于0、4、8、12、16、20、24 h 取培養(yǎng)液，在紫外分光光度計(jì)600 nm下測(cè)定OD值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法，菌液配制與黑大蒜提取物溶液配制同上。將黑大蒜提取物溶液以MH肉湯倍比稀釋成10個(gè)濃度，分別為 1000、512、…、2 μg/mL。將頭孢唑林和慶大霉素分別用MH肉湯倍比稀釋成10個(gè)濃度，即為 16、8、…、0.03 μg/mL。將配好的不同濃度的黑大蒜提取物溶液與頭孢唑林或慶大霉素按棋盤(pán)法設(shè)計(jì)，兩兩組合加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每種藥物加入50 μL，再將已校正濃度的菌液100 μL加入孔中，37℃培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。

1.2.8 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷 記錄單獨(dú)應(yīng)用兩藥的最低抑菌濃度MIC甲藥單用和乙藥單用，并選擇最佳組合效應(yīng)時(shí)兩藥聯(lián)合時(shí)各自的MIC甲藥聯(lián)用和乙藥聯(lián)用，以計(jì)算FIC指數(shù)。

FIC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用

FIC 指數(shù)≤0.5，協(xié)同作用

0.5 ＜FIC指數(shù)≤1，相加作用

1＜FIC指數(shù)≤2，無(wú)關(guān)作用

FIC指數(shù)＞2，拮抗作用

2 結(jié)果與分析

2.1 黑大蒜提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC測(cè)定結(jié)果

以頭孢唑林對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果作對(duì)照，即頭孢唑林對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為0.25 μg/mL(臨床推薦劑量?jī)?nèi))，黑大蒜提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為256 μg/mL。

2.2 黑大蒜提取物對(duì)大腸埃希菌的MIC測(cè)定結(jié)果

以慶大霉素對(duì)大腸埃希菌的抑菌效果作對(duì)照，即慶大霉素對(duì)大腸埃希菌的MIC值為0.25 μg/mL(臨床推薦劑量?jī)?nèi))，黑大蒜提取物對(duì)大腸埃希菌的MIC值為256 μg/mL。

2.3 黑大蒜提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的時(shí)間-殺菌曲線

結(jié)果如圖1所示，不加藥物的金黃色葡萄球菌對(duì)照的吸光度直線上升，而加入黑大蒜提取物后吸光度顯著下降，細(xì)菌生長(zhǎng)受到明顯抑制。當(dāng)加入濃度為MIC的黑大蒜提取物時(shí)，吸光度緩慢增長(zhǎng)，說(shuō)明細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制。當(dāng)達(dá)到培養(yǎng)16 h時(shí)，出現(xiàn)最低抑菌時(shí)間點(diǎn)，之后吸光度又有所升高。當(dāng)加入濃度為4MIC的黑大蒜提取物時(shí)，吸光度一直處于最初水平，說(shuō)明此濃度細(xì)菌生長(zhǎng)受到顯著抑制。結(jié)果證明黑大蒜提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用呈現(xiàn)較強(qiáng)的濃度依賴性。

圖1 不同濃度黑大蒜提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的時(shí)間-殺菌曲線Fig.1 Time-bactericidal curve of the black garlic extracts with different concentration against Staphylococcus aureus

2.4 黑大蒜提取物對(duì)大腸埃希菌的時(shí)間-殺菌曲線

結(jié)果如圖2所示，不加藥物的金黃色葡萄球菌對(duì)照的吸光度直線上升，而加入黑大蒜提取物后吸光度顯著下降，細(xì)菌生長(zhǎng)受到明顯抑制。當(dāng)加入濃度為MIC的黑大蒜提取物時(shí)，吸光度增長(zhǎng)緩慢且接近最初值，說(shuō)明細(xì)菌數(shù)量增長(zhǎng)緩慢。當(dāng)加入濃度為4MIC的黑大蒜提取物時(shí)，吸光度一直處于較低水平，說(shuō)明細(xì)菌生長(zhǎng)受到顯著抑制。黑大蒜提取物對(duì)大腸埃希菌的體外抑菌作用呈現(xiàn)較強(qiáng)的濃度依賴性。

圖2 不同濃度黑大蒜提取物對(duì)大腸埃希菌的時(shí)間-殺菌曲線Fig.2 Time-bactericidal curve of the black garlic extracts with different concentration against Escherichia coli

2.5 黑大蒜提取物與頭孢唑林聯(lián)用對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC測(cè)定結(jié)果

黑大蒜提取物聯(lián)合頭孢唑林對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，F(xiàn)IC指數(shù)為0.75，結(jié)果顯示黑大蒜提取物聯(lián)合頭孢唑林對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌作用表現(xiàn)為相加作用。

表1 黑大蒜提取物與頭孢唑林聯(lián)用對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC(μg/mL)Table 1 Table1 The MIC of black garlic extracts combined with Cefazolin against Staphylococcus aureus(μg/mL)

2.6 黑大蒜提取物與慶大霉素聯(lián)用對(duì)大腸埃希菌的MIC測(cè)定結(jié)果

黑大蒜提取物聯(lián)合慶大霉素對(duì)大腸埃希菌的MIC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，F(xiàn)IC指數(shù)為0.5，結(jié)果顯示黑大蒜提取物聯(lián)合慶大霉素對(duì)大腸埃希菌的抗菌作用表現(xiàn)為協(xié)同作用。

表2 黑大蒜提取物與慶大霉素聯(lián)用對(duì)大腸埃希菌的MIC(μg/mL)Table 2 The MIC of black garlic extracts combined with Gentamicin against Escherichia coli(μg/mL)

3 討論

金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌是醫(yī)院感染的常見(jiàn)病原菌。隨著抗生素的廣泛使用，葡萄球菌屬尤其是MRSA的檢出率和耐藥率有逐年增加的趨勢(shì)，而耐藥大腸埃希菌的檢出率也在逐年攀升，這成為臨床面臨的非常棘手的難題［5］。單獨(dú)使用一種抗菌藥物對(duì)嚴(yán)重的細(xì)菌感染作用有限，并易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性，因此臨床上越來(lái)越傾向于聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物來(lái)控制耐藥菌所致的嚴(yán)重感染?？咕幬锫?lián)合應(yīng)用的意義在于可增強(qiáng)抗菌藥物的協(xié)同抗菌作用，提高療效;發(fā)揮兩藥迅速而強(qiáng)大的殺菌作用，避免誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生;并可減少毒性較大的藥物劑量，降低不良反應(yīng)［6］。因此，在新型抗菌藥物面世之前，聯(lián)合用藥成為臨床必不可少的治療手段。大蒜素作為一種天然抗菌藥物，具有一定的抑制病原菌和真菌的作用，并具有生物性能好、不良反應(yīng)小以及具有免疫調(diào)節(jié)功能等特性。其抗菌原理在于大蒜素分子中的氧原子與細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所必須的半胱氨酸中的巰基結(jié)合，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖［7］。但多數(shù)的體外抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素MIC值較高，限制了它在抗感染治療中的應(yīng)用。已有研究報(bào)道黑大蒜較白大蒜含有更多的氨基酸、有機(jī)硫和S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine，SAC)，具有較普通大蒜更強(qiáng)的抗衰老、抗氧化和抗腫瘤作用［8］。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)時(shí)間-殺菌曲線證明黑大蒜提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均呈現(xiàn)較強(qiáng)的濃度依賴性。黑大蒜提取物與頭孢唑林或慶大霉素聯(lián)用后抗菌效果以相加和協(xié)同效應(yīng)為主，并可顯著降低兩種抗菌藥的MIC值。黑大蒜作為天然提取物，可在很大程度上避免兩類(lèi)抗菌藥物聯(lián)用后不良反應(yīng)增加的情況，同時(shí)，因黑大蒜在體內(nèi)有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，更有益于感染性疾病的治療。

［1］Pal R，Vaiphei K，Sikander A，et al.Effect of garlic on isoniazid and rifampicin-induced hepatic injury in rats［J］.World J Gastroenterol，2006，12(4):636-639.

［2］Shinkawa H，Takemura S，Minamiyama Y，et al.S-allylcysteine is effective as achemopreventive agent against porcine serum-induced hepatic fibrosis in rats［J］.Osaka City Med J，2009，55(2):61-69.

［3］Hiroyuki F，Kazuhiro W，Kazuhiro W，et al.Antibacterial potential of Garlic-derived allicin and its cancellation by sulfhydryl compounds［J］.Biosci.Biotechnol.Biochem，2009，73(9):1948-1955.

［4］Sasaki J，CH LU，Machiya E，et al.Processed black Garlic(allium sativum)extracts enhance anti-tumor potency against mouse［J］.Med Aroma J Plant Sci Biotech，2007，l(2):278-281.

［5］朱以軍，徐瑞龍，單曉云，等.醫(yī)院感染葡萄菌屬的分布特點(diǎn)與耐藥性［J］.中華醫(yī)院感染雜志，2007，17(5):599-602.

［6］蔡蕓，裴斐，鄭硯君，等.大蒜素聯(lián)合頭孢唑林或苯唑西林對(duì)葡萄球菌的抗菌作用［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2006，11(8):925-928.

［7］聞平，陳蕾，郭月芳.大蒜素對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的抑制作用［J］.微生物學(xué)雜志，2007，27(4):104-106.

［8］馮永輝，王慶輝，王美茹，等.黑大蒜提取物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答影響的初步探討.中國(guó)免疫學(xué)雜志［J］，2010，26(11):982-985.