李雪 葛長(zhǎng)明 李海粟 劉雙 陳迪 張本月 趙洪顏

摘要 [目的] 探索復(fù)合微生物菌系前處理秸稈生物質(zhì)資源的潛能。[方法] 從沼液環(huán)境中篩選木質(zhì)纖維素降解菌株BCM9，測(cè)定降解菌的分解特性和微生物群落的變化。[結(jié)果] BCM9的快速降解期是0～9 d；pH的變化是先降低后升高之后趨于穩(wěn)定；在第9天時(shí)，揮發(fā)性脂肪酸濃度，木聚糖酶活和纖維素酶活值最高，乳酸0.291 mg/L，甲酸0.31 mg/L，乙酸1.93 mg/L，丙酸0.73 mg/L，木聚糖酶活1.79 U/ml，纖維素酶活0.37 U/ml；微生物群落的多樣性也最豐富，屬于Clostridium sp.、Bacillus sp.、Geobacillus sp.。[結(jié)論] BCM9降解水稻秸稈的快速穩(wěn)定的降解期是第9天。

關(guān)鍵詞 水稻秸稈；微生物群落；揮發(fā)性有機(jī)酸

中圖分類號(hào) S181.3；X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）31-11052-03

The Dynamic of Microbial Community and Degradation Characteristics of Rice Straw by BCM9

LI Xue， GE Changming+， LI Haisu， ZHAO Hongyan* et al

（Agricultural College of Yanbian University， Yanji， Jilin 133002）

Abstract [Objective] To evaluate the potential utility of pretreatment of raw biomass with a complex microbial system. [Method] Lignocellulose was selected from biogas slurry environment to degrade strain BCM9， the degradation properties of the bacteria and microbial community change was determined. The degradation characteristics and corresponding changes in the bacterial community were assessed. [Result] The results showed that rapid degradation occurred from day 0 to day 9. The pH of the fermentation broth initially declined and then increased， and the mass of rice straw steadily decreased. The highest concentrations of volatile fatty acid contents （0.291 mg/L lactic acid， 0.31 mg/L formic acid， 1.93 mg/L acetic acid， and 0.73 mg/L propionic acid） as well as the highest xylanse activity （1.79 U/ml） and carboxymethyl cellulase activity （0.37 U/ml） occurred on day 9. The greatest diversity among the microbial community also occurred on day 9， with the presence of bacteria belonging to Clostridium sp.， Bacillus sp.， and Geobacillus sp. [Conclusion] BMC9 has a strong ability to rapidly degrade the lignocelluloses of rice straw under relatively inexpensive conditions， and the optimum fermentation time is 9 days.

Key words Rice straw； Microbial community； Volatile fatty acids

木質(zhì)纖維素是地球上最為豐富的生物資源，約占植物總干重的1/3～1/2，它能夠被微生物降解^[1]。秸稈是籽粒收獲后耕地上重要的農(nóng)業(yè)廢棄物資源，吉林省每年有超過(guò)0.6億t的秸稈廢棄物資源。由于秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物資源在自然狀態(tài)下極難分解，只能就地丟棄或焚燒，不能歸還土壤。大量待分解的秸稈不僅占用耕地還限制營(yíng)養(yǎng)元素歸還土壤，而且焚燒產(chǎn)生的煙塵影響生態(tài)環(huán)境和人類健康。因此，如何將秸稈變廢為寶是實(shí)現(xiàn)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要課題^[2]。

崔宗均等突破傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)分離方法，在不破壞自然界中微生物之間協(xié)同關(guān)系的前提下，將酸堿反應(yīng)不同的菌群優(yōu)化組合，篩選和馴化了高效而穩(wěn)定的纖維素分解復(fù)合菌系MC1、XCD2、WDC2等復(fù)合系[1，3-4]。此復(fù)合系的降解能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于純培養(yǎng)的單個(gè)菌株，在8 d內(nèi)可完全降解水稻秸稈^[5]。而且這些復(fù)合系對(duì)在厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷過(guò)程中有顯著的優(yōu)勢(shì)，但是這些復(fù)合系都是從畜禽糞便堆肥環(huán)境中篩選出來(lái)的。因此，該研究是從沼液厭氧環(huán)境中篩選出BCM9復(fù)合系，為秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的酸化處理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以筆者實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的木質(zhì)纖維素分解復(fù)合菌系BCM9作為菌種，培養(yǎng)基為蛋白胨纖維素培養(yǎng)液（PCS），其成分為5 g蛋白胨，5 g NaCl，2 g CaCO3，1 g 酵母粉及1 L的去離子水。配制800 ml PCS培養(yǎng)基于1 L的三角瓶中，添加8 g水稻秸稈，121 ℃滅菌15 min。水稻秸稈經(jīng)1.5%NaOH堿液浸泡48 h后，用自來(lái)水沖洗到pH為7.0左右，105 ℃烘干后，將其剪到合適的長(zhǎng)度以便放入300 ml的三角瓶中。調(diào)節(jié)pH試驗(yàn)中，需配制1%、2%、3%NaOH溶液用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH。更換培養(yǎng)基試驗(yàn)中需配制新鮮的PCS培養(yǎng)基。

1.2 培養(yǎng)條件

每個(gè)300 ml的三角瓶中裝入238 ml PCS培養(yǎng)基，稻稈的添加量分別為培養(yǎng)基體積的5%（W/V）。培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌15 min后備用。將培養(yǎng)3 d的BCM9菌種按照5%體積的接種量接種到新鮮培養(yǎng)基中，60 ℃下靜置培養(yǎng)。

1.3 水稻秸稈分解過(guò)程中pH的測(cè)定

pH的測(cè)定方法：取0.2 ml培養(yǎng)液，滴于HORIBA微型pH計(jì)（model B212，HORIBA，Japan）中進(jìn)行測(cè)定。

1.4 BCM9分解后秸稈各成分測(cè)定

將烘干后的秸稈殘?jiān)鬯椴⑦^(guò)1 mm的篩子，稱取0.5 g裝入濾袋，3個(gè)重復(fù)，按照ANKOM220纖維分析儀操作規(guī)程及技術(shù)資料測(cè)定秸稈的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量。

1.5 BCM9發(fā)酵液中有機(jī)酸含量測(cè)定

發(fā)酵液樣品經(jīng)8 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.22 μm 濾膜，在-40 ℃冰凍下保存，待樣品收集全后，用島津QP2010 型氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）測(cè)定，測(cè)定分析柱為CPChirasilDex CB（25 m ×0.25 mm）毛細(xì)管柱；柱箱溫度50 ℃（1 min）→100 ℃（1 min），7 ℃/ min →195 ℃（2 min），18 ℃/ min，共14 min；進(jìn)樣口溫度190 ℃；檢測(cè)器溫度200 ℃；載氣He（60 kPa），流量34 ml/min；分流比1/22；監(jiān)測(cè)器電壓115 kV；進(jìn)樣量1 μl。對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)，利用NIST 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性分析。根據(jù)出峰物的定性分析結(jié)果，配制相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣品的稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)樣，用于該物質(zhì)的定量分析^[4]。

1.6 纖維素酶和木聚糖酶活力的測(cè)定

纖維素酶活力測(cè)定和木聚糖酶活力測(cè)定參見^[2-3]等方法。其中纖維素酶活力單位定義為：酶液在1 min內(nèi)消耗纖維素產(chǎn)生1 mmol葡萄糖作為1 U；木聚糖酶活力單位（IU）定義為1 min水解木聚糖底物生成1 μg木糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.7 微生物動(dòng)態(tài)群落動(dòng)態(tài)分析

培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min離心15 min，棄上清收集菌體細(xì)胞，按照Benzyl chloride方法^[6]提取微生物的總DNA。16S rDNA的PCR擴(kuò)增使用AmpliTaq GoldTM（Perkin Elmer，Japan），引物為357FGC（GC clamp5′CCTACGGGAGGCAGCAG3′）和517R（5′GTGCCAGC（A/C）GCCGCGG3′）。用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析^[7-8]。從膠上回收DNA條帶，測(cè)定其序列，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，進(jìn)行相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻秸稈降解過(guò)程中pH的變化

據(jù)報(bào)道，纖維素降解pH范圍為5.9～8.5^[6]。由圖1可知，水稻秸稈降解過(guò)程中2 d內(nèi)發(fā)酵液的pH迅速地從7.4下降到6.2，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，pH逐漸上升，第12天時(shí)達(dá)到8.3。

2.2 BCM9分解后秸稈各成分測(cè)定結(jié)果

由圖2可知，水稻秸稈的生物量總干重12 d后下降了75%。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成成分的質(zhì)量分別降低了97.11%、74.70%和48.00%。前期研究報(bào)道的MC1的降解率為：生物量總干重減少81%，纖維素含量減少99%，半纖維素減少74%，木質(zhì)素減少24%。比較表明，BMC9和MC1對(duì)水稻秸稈的木質(zhì)纖維素具有很強(qiáng)的分解能力。這為BMC9降解木質(zhì)纖維素沼氣發(fā)酵酸化階段的機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ)。

2.3 纖維素酶和木聚糖酶活力的測(cè)定結(jié)果

為檢測(cè)BMC9對(duì)水稻秸稈的降解能力，測(cè)定了12 d內(nèi)纖維素酶活性和木聚糖酶活性的變化。結(jié)果表明，木聚糖酶的活性逐漸上升，在第9天時(shí)呈現(xiàn)峰值，為1.79 U/ml。纖維素酶活性在第9天達(dá)到最大值，0.37 U/ml（圖3）。酶活性的分析表明，BMC9對(duì)水稻秸稈分解能力最強(qiáng)的是在第9天。

它能夠降解木質(zhì)素生產(chǎn)生物表面劑，促進(jìn)難降解有機(jī)物的微生物分解，提高堆肥效率，縮短堆肥周期。條帶2、3、4、5、6、7、9、10、11、13、14、16是Clostridium sp.，據(jù)報(bào)道在堆肥環(huán)境中導(dǎo)致堆體溫度的快速上升，并具備能力降解纖維素^[3]。

3 結(jié)論

（1）水稻秸稈降解菌在降解過(guò)程中，發(fā)酵液pH先降低后升高，趨于穩(wěn)定。

（2）降解后水稻秸稈的總生物量降低了75%，纖維素降低了97.11%，半纖維素降低了74.70%，木質(zhì)素降低了48.00%。

（3）降解過(guò)程中揮發(fā)性脂肪酸、木聚糖酶活、纖維素酶活在第9天時(shí)數(shù)值最高。

（4）第9天時(shí)，發(fā)酵液中細(xì)菌微生物群落最為豐富，分別是Bacillus sp.、Clostridium sp.和Geobacillus sp.屬菌株。

參考文獻(xiàn)

[1] 崔宗均，樸哲，王偉東，等.一組高效穩(wěn)定纖維素分解菌復(fù)合系MC1的產(chǎn)酶條件[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23（2）：296-299.

[2] 劉長(zhǎng)莉，王小芬，郭鵬，等.常溫秸稈還田菌群的篩選及分解稻稈特性研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（1）：105-111.

[3]呂育財(cái)，朱萬(wàn)斌，崔宗均，等.纖維素分解菌復(fù)合系WDC2 分解小麥秸稈的特性及菌群多樣性[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，14（5）：40-46.

[4] PENG G，ZHU W，WANG H，et al.Functional characteristics and diversity of a novel lignocelluloses degrading composite microbial system with high xylanase

activity[J].Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，20：254-264.

[5] 崔宗均，李美丹，樸哲，等.一組高效穩(wěn)定纖維素分解菌復(fù)合系MC1 的篩選及功能[J].環(huán)境科學(xué)，2002，23（3）：36-39.

[6] ZHU H，QU F，ZHU L H.Isolation of genomic DNAs from plants，fungi and bacteria using benzyl chloride[J].Nucleic Acids Research，1993，21：52-79.

[7] MUYZER G，DE WAAL E C，UITTERLINDEN A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reactionamplified genes coding for 16S rRNA[J].Applied and Environmental Microbiology，1993，59：695-700.

[8] WANG X，HARUTA S，WANG P，et al.Diversity of a stable enrichment culture which is useful for silage inoculant and its succession in alfalfa silage[J].FEMS Microbiology Ecology，2006，57：106-115.