呂微 王先哲 陳瑩瑩 崔成都 婁安鋼

摘要 采用病理解剖學(xué)和病理組織學(xué)技術(shù)對(duì)1例疑似大葉性肺炎而死亡的紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬進(jìn)行病理診斷。結(jié)果表明，病豬主要病變體現(xiàn)在肺臟，肺充滿整個(gè)胸腔，表面附有絮狀滲出物，呈灰紅色，局部可見(jiàn)暗紅色的出血斑，質(zhì)硬如肝，切面干燥，投入水中完全下沉；顯微鏡下主要呈現(xiàn)大葉性肺炎的紅色肝變期和灰色肝變期的病變特點(diǎn)，心、肝、腎、脾、胰腺等其他器官充血，可見(jiàn)輕微的細(xì)胞變性，結(jié)合其臨床癥狀，確診為大葉性肺炎。此外，死亡紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬的各組織器官呈紅色，顏色深淺因不同器官而有差異。這將為進(jìn)一步探討紅色熒光轉(zhuǎn)基因豬的研究提供病理學(xué)基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞 紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬；大葉性肺炎；病理學(xué)

中圖分類號(hào) S828 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）31-10979-03

The Pathological Observation of Lobar Pneumonia of the Red Fluorescence Transgenic Wuzhishan Pig

LV Wei1， WANG Xianzhe1， CHEN Yingying2， LOU Angang1* et al

（1.Animal Medicine Department of Agriculture College of Yanbian University， Yanji， Jilin 133000；2.Animal Husbandry Administration Bureau in Longjing City of Jilin Province， Longjing， Jilin 133400）

Abstract The pathological anatomy and pathologic histology technology was used for the pathological diagnosis of a case of red fluorescence transgenic Wuzhishan pig died of the suspected lobar pneumonia desease. The results showed that the main pathological change of the pig was in the lung. The specific characteristics was that the lung filled the entire chest and was attached by flocculent exudate on its surface. Also， the lung was grayish red and had many dark red visible local bleeding spots and was as hard as the liver， and the section of the lung was dry and the lung completely sunk in the water. The lung appeared the pathological features of the main lobar pneumonia red and gray hepatization under the microscope. The heart， liver， kidney， spleen， pancreas and other organs congested and the slight degeneration of cells could be seen. The lobar pneumonia desease was diagnosed according to the above results and clinical symptoms. In addition， every organ of the died red fluorescence transgenic Wuzhishan pig was red and the red color depth was different among the different organs. The test results will further provide a pathological basis for the study of red fluorescence transgenic pig.

Key words Red fluorescence Wuzhishan transgenic pigs； Lobar pneumonia； Pathology

大葉性肺炎（Lobar pneumonia）是以肺泡內(nèi)滲出大量纖維素為特征的急性炎癥，通常又稱為纖維素性肺炎。此型肺炎常侵犯一個(gè)大葉、一側(cè)肺臟或全肺，肺組織發(fā)生大面積廣泛實(shí)變?yōu)槠涮攸c(diǎn)^[1]。

大葉性肺炎根據(jù)其病變特點(diǎn)通常分為4期，各期變化是這個(gè)連續(xù)發(fā)展過(guò)程的不同階段：①充血水腫期：大葉性肺炎的初期，發(fā)病第1～2天的變化，主要以肺泡毛細(xì)血管充血和漿液性水腫為其病變特點(diǎn)。臨床上此期病變較輕，除一些特急性豬肺疫病例外，患畜很少死亡；②紅色肝變期：由充血水腫期發(fā)展而來(lái)，一般發(fā)病第2～3天進(jìn)入此期，其病變特點(diǎn)是肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡腔內(nèi)有大量纖維素、紅細(xì)胞滲出。臨床上此期可發(fā)現(xiàn)病畜粘膜發(fā)紺，呼吸困難，部分病畜可見(jiàn)到鐵銹色鼻液及胸部疼痛的臨床癥狀；③灰色肝變期：是紅色肝變期的繼續(xù)，通常發(fā)病后第5～6天進(jìn)入此期，此期的病變特點(diǎn)是：肺泡壁毛細(xì)血管呈貧血狀，支氣管腔和肺泡腔中纖維。流入左心。因此，動(dòng)物常常因缺氧、呼吸困難而死亡^[1-4]。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬是由2012年延邊大學(xué)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與胚胎工程研究所，以反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的帶有紅色熒光蛋白（RFP）基因的豬胎兒成纖維細(xì)胞作為核移植的核供體，利用體細(xì)胞克隆技術(shù)克隆出紅色熒光蛋白克隆胚胎，并移植于受體而生產(chǎn)出的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。該豬飼養(yǎng)于延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院養(yǎng)豬場(chǎng)，死亡前1周該豬開始病豬體溫升高，呈稽留熱型，食欲減退，精神萎頓，行動(dòng)遲緩，肌肉顫栗，呼吸急促而費(fèi)力，鼻流鐵銹色鼻液，臨床采用抗生素治療3 d，治療無(wú)效于2013年3月5日死亡。為了確診其死亡原因，筆者采用病理解剖學(xué)和病理組織學(xué)方法，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)觀察，以期為臨床提供病理學(xué)的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由延邊大學(xué)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與胚胎工程研究所提供的1只患病死亡紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病理解剖學(xué)方法。在肉眼檢查紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬尸體外部狀況的基礎(chǔ)上，借助解剖刀、鑷子、剪刀等解剖器械，檢查肝、脾、腎、心、肺、子宮、輸卵管、胰腺、腎上腺等器官并切取組織固定，用于病理組織學(xué)檢查。

1.2.2 病理組織學(xué)檢查方法。固定組織通過(guò)水洗、脫水、石蠟包埋等過(guò)程制作石蠟組織切片，進(jìn)行常規(guī)染色后于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理解剖學(xué)觀察結(jié)果

2.1.1 體表。病豬尸體營(yíng)養(yǎng)狀況不良，鼻唇發(fā)紺，鼻腔內(nèi)可見(jiàn)鐵銹色鼻液，體表皮膚呈淡紅色，尤其腹部和四肢末端更明顯（圖1）。

2.1.2 器官病理變化。

2.1.2.1 肺臟。肺腫脹，充滿整個(gè)胸腔，表面被覆絮狀分泌物，呈灰紅色，局部可見(jiàn)出血斑，質(zhì)硬如肝，間質(zhì)增寬，按壓時(shí)有大量泡沫狀液體，水中完全下沉（圖2a）。

2.1.2.2

心臟。心臟表面變化不明顯，局部組織呈鮮紅色（圖2b）。

2.1.2.3 肝臟。肝臟呈暗紅色，膽囊腫大（圖2c）。

2.1.2.4 子宮。子宮顏色呈暗紅、淤血、血管腫脹，整體顏色發(fā)紅（圖2d）。

2.1.2.5 腎臟。腎臟外表有液體流出，腎顏色呈暗紅色沒(méi)有肝表現(xiàn)明顯，有輕微淤血（圖2e）。

2.1.2.6 腹腔內(nèi)各器官。膽囊腫脹，肝臟呈暗紅，腸管內(nèi)充氣，胰腺顏色發(fā)紅，子宮、腸管和胃均為淡紅色，顏色比較明顯，表現(xiàn)出了紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬的紅色熒光蛋白基因表達(dá)（圖2f）。

2.2 病理組織學(xué)觀察結(jié)果

2.2.1 肺臟。肺泡腔和支氣管內(nèi)有大量炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，支氣

管上皮脫落，周邊出血、充血，氣管腺有大量炎性細(xì)胞侵

潤(rùn)。肺部肺泡隔毛細(xì)血管高度擴(kuò)張充血，而另一部分充血消失，只見(jiàn)大量炎性細(xì)胞，這種表現(xiàn)明顯處于紅色肝變期和灰色肝變期之間（圖3a～d）。

2.2.2 胰腺。胰腺細(xì)胞壞死，細(xì)胞漿凝固，紅染，胞漿發(fā)紅，組織結(jié)構(gòu)可以辨認(rèn)，但壞死細(xì)胞呈多種變化（圖3e）。

2.2.3 肝臟。肝臟嚴(yán)重淤血，肝竇擴(kuò)張，充滿了紅細(xì)胞，肝索排列紊亂，胞漿顏色上與正常豬相比有很大差異，體現(xiàn)出紅色熒光蛋白在其中有表達(dá)作用（圖3f）。

2.2.4 子宮。子宮有淤血，無(wú)其他癥狀，顏色與正常豬對(duì)比組織顏色發(fā)紅（圖3g）。

3 討論與結(jié)論

大葉性肺炎早期肺臟略增大，有一定彈性，病變部位肺組織呈褐紅色，切面光澤而濕潤(rùn)，按壓流出大量血樣泡沫，切面光澤而濕潤(rùn)，按壓流出大量血樣泡沫。一般紅色肝樣變期可見(jiàn)受累肺葉腫大，質(zhì)地變實(shí)，切面灰紅色，較粗糙，胸膜表面可見(jiàn)纖維素性滲出物^[1]。顯微鏡下，肺泡壁毛細(xì)血管仍擴(kuò)張充血，肺泡腔內(nèi)充滿含大量紅細(xì)胞、一定量纖維素、少量嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的滲出物?；疑巫兤谌庋劭梢?jiàn)肺葉腫脹，質(zhì)實(shí)如肝，切面干燥粗糙，肺泡腔內(nèi)的紅細(xì)胞大部分溶解消失，而纖維素滲出顯著增多，因此實(shí)變區(qū)呈灰白色。顯微鏡下，肺泡腔滲出物以纖維素為主，纖維素網(wǎng)中見(jiàn)大量嗜中性粒細(xì)胞，紅細(xì)胞較少。

此次觀察發(fā)現(xiàn)病豬生前體溫升高，呈稽留熱型，食欲減退，精神萎頓，行動(dòng)遲緩，肌肉顫栗，呼吸急促而費(fèi)力，病豬尸體營(yíng)養(yǎng)狀況不良，鼻唇發(fā)紺，流鐵銹色鼻液、膽囊腫脹，肝臟呈暗紅，腸管內(nèi)充氣，肺葉腫脹，重量增加，間質(zhì)增寬，表面被覆一薄層纖維素性滲出物。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)病變肺葉仍腫脹，呈灰白色，質(zhì)實(shí)如肝，顯微鏡下可見(jiàn)各組織均有淤血和充血現(xiàn)象而肺部肺泡腔內(nèi)滲出物繼續(xù)增加，充滿中性粒細(xì)胞和纖維素，肺泡壁毛細(xì)血管受壓，肺組織呈貧血狀。肺泡腔和支氣管內(nèi)有大量炎性細(xì)胞，支氣管上皮脫落，周邊出血充血，氣管腺內(nèi)有大量炎性細(xì)胞，肺部肺泡隔毛細(xì)血管高度擴(kuò)張充血，而另一部分充血消失，因此處于紅色肝樣變和灰色肝樣變之間。經(jīng)初步確診，確定五指山豬死亡的主要原因是由于非傳染性大葉性肺炎導(dǎo)致呼吸困難而致機(jī)體缺氧死亡。

轉(zhuǎn)基因豬技術(shù)的研究可為實(shí)現(xiàn)快速目標(biāo)育種、改善人類異種器官移植供體器官的來(lái)源、生產(chǎn)特定人類疾病模型豬等工作提供重要基礎(chǔ)。該研究對(duì)我國(guó)體細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)基因豬的研究具有重要的參考價(jià)值。通過(guò)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究可以為其他各類具有重要應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究提供良好的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。以核移植技術(shù)路線最早出生的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬是2002 年由美國(guó)的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室完成的，此后相繼有不同實(shí)驗(yàn)室獲得了綠色熒光轉(zhuǎn)基因豬^[5]。國(guó)內(nèi)也有關(guān)于紅色熒光轉(zhuǎn)基因豬的相關(guān)報(bào)道，研究獲得了 4 頭以核移植技術(shù)路線制作的紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬，其中2頭已經(jīng)健康生長(zhǎng)，各發(fā)育指標(biāo)均表現(xiàn)正常。 該結(jié)果表明目前已經(jīng)具備采用體細(xì)胞核移植技術(shù)路線制作轉(zhuǎn)基因豬的全部技術(shù)，為下一步實(shí)現(xiàn)人類疾病模型轉(zhuǎn)基因豬和轉(zhuǎn)基因育種等具有重要應(yīng)用價(jià)值的研究工作打下了良好的基礎(chǔ)。

該試驗(yàn)以紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有重要的科學(xué)實(shí)驗(yàn)意義。對(duì)于出生后死亡的個(gè)體，分別取心臟、肺臟、腎臟、脾臟、等組織，在熒光檢測(cè)下紅色熒光蛋白表達(dá)情況與正常豬相比表現(xiàn)非常明顯，各組織熒光蛋白均在其中有表達(dá)，但表達(dá)效果完全不一。紅色熒光轉(zhuǎn)基因五指山豬皮膚及各臟器均呈紅色，顏色深淺因不同器官而有差異。今后應(yīng)該進(jìn)一步研究更好的試驗(yàn)方法予以證實(shí)。

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