李墨野 趙慧 姜洋 劉笑平 林永紅 李開隆

摘要 [目的]用生物信息學(xué)手段分析、預(yù)測毛白楊PLC2基因/蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與特征，為該基因的克隆及功能研究提供理論參考。[方法]以PLC2基因及對應(yīng)蛋白質(zhì)為研究對象，利用各種網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫及生物信息學(xué)分析軟件對其進行相關(guān)分析、預(yù)測。[結(jié)果]PLC2基因的GenBank登錄號為JX424764.1，ORF長957bp，編碼318個氨基酸，對應(yīng)蛋白質(zhì)PLC2的分子量35 999.1D，理論等電點7.07；PLC2與毛果楊（XP_002313726.1）的同源性較高；PLC2屬于PIPLCc_GDPD_SF超家族，無O糖基化位點，無二硫鍵，無跨膜區(qū)和信號肽，有16個磷酸化位點。[結(jié)論]對PLC2基因/蛋白的各級結(jié)構(gòu)及功能進行預(yù)測，為下一步試驗奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 毛白楊；磷酸肌醇特異性磷脂酶C；生物信息學(xué)

中圖分類號 S188 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）31-10867-06

Bioinformatics Analysis of Populus tomentosa cultivar BJHR01 Phosphoinositidespecific phospholipase C （PLC2） Gene

LI Moye， ZHAO Hui， JIANG Yang， LI Kailong et al

（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To analyze and predict the structure and feature of Populus tomentosa PLC2 gene/protein through bioinformatics method， and provide theoretical foundation for gene cloning and function research. [Method] Utilize various online databases and bioinformatics software to predict PLC2 gene and its corresponding protein. [Result] The GenBank accession number of PLC2 is JX424764.1， ORF is 957bp in length， encoding 318aa； the molecular weight of PLC2 is 35 999.1D， theoretical isoelectric point is 7.07； PLC2 has a higher homology with XP_002313726.1， belonging to PIPLCc_GDPD_SF superfamily， has no Oglycosylation site， no disulfide bond， no transmembrane domain or signal peptide， but 16 phosphorylation sites. [Conclusion] This study has predicted the structure and function of PLC2 gene/protein and paved the way for the following experiments.

Key words Populus tomentosa； Phosphoinositidespecific phospholipase C； Bioinformatics

毛白楊（Populus tomentosa）是以黃河中、下游流域為中心而廣泛分布的楊柳科落葉喬木，該樹種適應(yīng)能力較強，是速生用材林，為防護林和行道河渠綠化的理想選擇^[1]。磷酸肌醇特異性磷脂酶C是真核生物胞內(nèi)酶，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用^[2]。它能催化1磷脂酶D肌醇肌糖4，5二磷酸水解成第二信使物質(zhì)甘油二脂、肌糖1，4，5三磷酸的反應(yīng)，這個催化作用還受到可逆磷酸化反應(yīng)以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的調(diào)控^[3-5]。筆者通過生物信息學(xué)手段對毛白楊（BJHR01種）磷酸肌醇特異性磷脂酶C（phosphoinositidespecific phospholipase C，PLC2）基因的核酸/蛋白質(zhì)序列的分子特征、一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)以及三維結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測，并對該蛋白進行了系統(tǒng)進化分析，從而為下一步的分子生物學(xué)試驗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所選材料為毛白楊（BJHR01種）磷酸肌醇特異性磷脂酶C基因，GenBank登錄號：JX424764.1。

1.2 方法

利用BioEditClustalW軟件對11個物種的磷酸肌醇特異性磷脂酶氨基酸序列進行多序列比對；應(yīng)用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用ExPASy中的ProtParam工具（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行在線分析；通過NetOGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）進行糖基化位點的預(yù)測；通過NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對PLC 2的磷酸化位點進行預(yù)測；利用在線工具COILS預(yù)測PLC2的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)；利用PredictProtein和psipred預(yù)測PLC2蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用PROSITE（http：//prosite.expasy.org/）確定出PLC 2的活性部位；利用在線工具PredictProtein（http：//www.Predictprotein.org/）和 TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）方法預(yù)測PLC2氨基酸序列可能的跨膜區(qū)；應(yīng)用SignalP在線預(yù)測毛白楊磷酸肌醇特異性磷脂酶C的信號肽；利用SWISS MODEL（http：//swissmodel.expasy.org）預(yù)測PLC2蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；用Raswin和spdbiew軟件查看三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLC2基因及相應(yīng)氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)

2.1.1 plc2基因的開放讀碼框及翻譯。

首先檢索NCBI中的GenBank獲得PLC2基因的完整cds，再利用ORF Finder查找其開放讀碼框，獲得一條長957 bp的完整ORF，利用SMS在線翻譯（+1框）該核酸序列，結(jié)果見圖1。

2.1.2 plc2基因的染色體定位。

利用NCBI中的工具MapViewer初步檢索毛果楊基因組，使用普通檢索和高級檢索，均未找到與之匹配的結(jié)果。于JGI數(shù)據(jù)庫進行BLAT Search，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在毛果楊的第9號和第4號染色體上的得分最高，分別為1 583.0、1 825.0，相似程度分別為90.6%、98.7%（圖2）。由于毛果楊與毛白楊親緣關(guān)系較近，因此推測PLC2基因可能位于毛白楊栽培種BJHR01的第4或第9號染色體上。

2.1.3 氨基酸序列分析。

經(jīng)過ExPASy在線軟件分析，得出PLC2氨基酸數(shù)目為318，相對分子質(zhì)量為35 999.1 D，理論等電點（pI）為7.07。在PLC2中，亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）和纈氨酸（Val）3種氨基酸含量最高，均為7.5%。甲硫氨酸含量最低（Met），僅為1.3%（圖3）。PLC2蛋白原子組成為C∶H∶N∶O∶S=1 603∶2 530∶440∶478∶12，即分子式為C1603H2530N440O478S12，原子總數(shù)為5 063。不穩(wěn)定系數(shù)為38.26。

2.1.4 PLC2的親疏水性分析。

利用ProtScale軟件繪制毛白楊磷酸肌醇特異性磷脂酶C親疏水性列譜，以預(yù)測其折疊情況。使用Hphob./Kyte&Doolittle算法進行預(yù)測，見圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)僅存在1個高分值峰（Score>1.5），分布在第300～310位殘基之間；而3個低分值（Score<0）的峰分別位于第40～50、150～160、190～200氨基酸殘基位點附近，可初步推測這3個位置為蛋白質(zhì)的卷曲結(jié)構(gòu)部位。

3 討論

該研究通過生物信息學(xué)的方法對PLC2基因的DNA序列、蛋白質(zhì)序列進行了分析，并預(yù)測了相應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。利用PROSITE預(yù)測出該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域為PIPLC_X_DOMAIN，位于第57～185位氨基酸殘基之間，其中以2個組氨酸（H）為活性中心位點，即為該酶的催化活性中心。序列比對表明，PLC2的PIPLC_X_DOMAIN結(jié)構(gòu)域在不同物種中具有很高的保守型。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析顯示該酶無卷曲結(jié)構(gòu)，無二硫鍵，無明顯的跨膜區(qū)，且未預(yù)測出信號肽。筆者還利用SWISS MODEL（Automated Mode）預(yù)測了PLC2的三維構(gòu)型，結(jié)果表明，QMEAN Z-Score=-6.19，與模板蛋白序列比對的一致性也非常低（14.92%），說明預(yù)測結(jié)果可信度不高，原因可能是該蛋白質(zhì)本身不穩(wěn)定或是所選靶標(biāo)蛋白不當(dāng)，下一步通過Robetta BETA從頭預(yù)測PLC2蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

另外，筆者通過研究發(fā)現(xiàn)，使用不同的分析工具對同一條序列進行分析，可能會得到不同的結(jié)果，這可能是因為不同的軟件所應(yīng)用的計算方法各異。因此，該研究對PLC2/PLC2的所有預(yù)測結(jié)果僅能作為參考，具體功能研究還需要經(jīng)過大量嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑囼炦M行驗證。

參考文獻

[1]

張美霞，馬海燕.毛白楊栽培技術(shù)及應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技.2014（3）：45

[2] MELDRUM E，PARKER P J，CAROZZI A.The PtdInsPLC superfamily and signal transduction[J].Biochim Biophys Acta，1991，1092（1）：49-71.

[3] RHEE S G，CHOI K D.Multiple forms of phospholipase C isozymes and their activation mechanisms[J].Adv Second Messenger Phosphoprotein Res，1992，26：35-61.

[4] RHEE S G，CHOI K D.Regulation of inositol phospholipidspecific phospholipase C isozymes[J].J Biol Chem，1992，267（18）：12393-12396.

[5] STERNWEIS P C，SMRCKA A V.Regulation of phospholipase C by G proteins[J].Trends Biochem Sci，1992，17（12）：502-506.

[6] 朱琍燕，吳士良.蛋白質(zhì)的糖基化作用分類及相關(guān)數(shù)據(jù)庫[J].生命的化學(xué)，2007（2）：108-111.

[7] RHEE S G，BAE Y S.Regulation of phosphoinositidespecific phospholipase C isozymes[J].J Biol Chem，1997，272（24）：15045-15048.

[8] REBECCHI M J，PENTYALA S N.Structure，function，and control of phosphoinositidespecific phospholipase C[J].Physiol Rev，2000，80（4）：1291-1335.

[9] MCGUFFIN L J，BRYSON K，JONES D T.The PSIPRED protein structure prediction server[J].Bioinformatics，2000，16（4）：404-405.