王俊峰 尹堯 陳玉花 加春生 王曉楠

摘要 [目的] 從抗生素廢水處理的活性污泥中篩選出具有高效降解能力的菌株。[方法]從抗生素制藥工業(yè)廢水處理的活性污泥中分離到1株抗生素高效降解菌NG3，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定和16SrDNA序列比對(duì)分析，同時(shí)對(duì)該菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究。[結(jié)果]從抗生素制藥工業(yè)廢水處理的活性污泥中分離得到1株抗生素高效降解菌NG3，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定和16SrDNA序列比對(duì)分析，確定該菌株屬于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.），命名為Acinetobacter sp.NG3。[結(jié)論] 為抗生素類(lèi)工業(yè)廢水高效處理提供借鑒。

關(guān)鍵詞 抗生素； 16SrDNA ；Acinetobacter；降解菌

中圖分類(lèi)號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）31-10851-02

Screening and Its Degrading Properties of Effective Degradation Strains for Antibiotic Production Wastewater Treatment

WANG Junfeng1 ，YIN Yao2， CHEN Yuhua1 et al

（1.Heilongjiang Agricultural Engineering Vocational College， Harbin，Heilongjiang 150088； 2.Harbin Pharmaceutical Group biovaccine Co. Ltd， Harbin，Heilongjiang 150025 ）

Abstract [Objective] The aim was to screen effective degradation strains from activated sludge treatment of antibiotic wastewater. [Method] Through selective enrichment culture a effective degradation strains NG3 was isolated from antibiotic production wastewater treatment， physicbiochemical identification and phylogenetical analysis of 16S rDNA sequence were carried out.[Result] Through selective enrichment culture a effective degradation strains NG3 was isolated from antibiotic production wastewater treatment. Based on the results of physicbiochemical identification and phylogenetical analysis of 16S rDNA sequence，the strain was belonged to Acinetobacter，named as Acinetobacter sp.NG3.[Conclusion] The study provided reference for effective treatment of industrial waste for antibiotic.

Key words Antibiotics ；16S rDNA； Acinetobacter； Aiodegradation

近年來(lái)，隨著抗生素制藥工業(yè)的快速發(fā)展，抗生素工業(yè)廢水已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生態(tài)環(huán)境平衡的棘手問(wèn)題，對(duì)抗生素制藥工業(yè)廢水進(jìn)行有效處理已經(jīng)刻不容緩，成為制約社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的緊要問(wèn)題^[1]?？股厣a(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生大量的發(fā)酵液、酸廢水、堿廢水和有機(jī)溶劑廢水等。其具有有機(jī)物濃度高、存在生物毒性物質(zhì)、色度高、氣味重、pH波動(dòng)大等特征^[2]。目前，抗生素制約工業(yè)廢水處理方法主要有化學(xué)處理法、物化處理法（包括混凝-沉淀法、反滲透-膜分離法、吸附法、光降解法、包埋法及電解法等）、生物處理法以及多種方法復(fù)合處理等。其中生物處理方法具有處理?xiàng)l件較為溫和、微生物適應(yīng)性較強(qiáng)、費(fèi)用低廉、較易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于抗生素制藥工業(yè)廢水的處理^[3]。筆者試圖從抗生素廢水處理的活性污泥中篩選出具有高效降解能力的菌株，并研究其生物降解特性，應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，以期為抗生素類(lèi)工業(yè)廢水高效處理提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 水樣 試驗(yàn)水樣取自哈爾濱某制藥企業(yè)廢水排放口，活性污泥取自曝氣池的回流污泥。

1.2 培養(yǎng)基

①無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO4 0.9 g/L，Na2HPO4·12H2O 6.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，（NH4）2SO4 0.4 g/L，微量元素1 ml，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。②LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，固體培養(yǎng)基中瓊脂含量為1.5%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高效降解菌株的分離篩選。

（1）增殖培養(yǎng)：取2 ml活性污泥沉淀的上清液，接種到裝液量200 ml的三角瓶中，于30 ℃、100 r/min下培養(yǎng)48 h，而后進(jìn)行瓊脂平板劃線(xiàn)分離，分離得到的單菌落經(jīng)多次反復(fù)分離、純化后得到純菌株^[4]。

（2）菌株篩選：將分離純化得到的菌落特征較典型、性狀較優(yōu)良的純菌株分別接種到含50%廢水的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30 ℃、100 r/min條件下培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌體的生長(zhǎng)情況和對(duì)COD的去除率，篩選出降解率高的優(yōu)勢(shì)菌株^[5-6]。

1.3.2 菌株的鑒定。

（1）形態(tài)、培養(yǎng)及生理生化特征鑒定。對(duì)純培養(yǎng)菌株的菌落特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征進(jìn)行觀察與鑒定，同時(shí)采用透射電鏡進(jìn)行觀察^[7]。

（2）16SrDNA序列分析法鑒定。以細(xì)菌總DNA為模板，選取一對(duì)細(xì)菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，其核酸序列如下：引物BSF8/20：5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3（E.coli16s rDNA對(duì)應(yīng)位點(diǎn)為8～27）；引物BSR1541＼20：5AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3（E.coli的16s rDNA對(duì)應(yīng)位點(diǎn)為1541～1522）。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性1min，55 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，在此條件下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后在72 ℃下保溫10 min，測(cè)序由大連寶生物工程有限公司完成。將菌株NG3 16s rDNA核酸序列通過(guò)Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析（http：//ncbi.nlm.nih.gov＼blast），由GenBank中得到相關(guān)菌株的序列，與該研究所測(cè)的序列一起輸入Clustalx1.8程序進(jìn)行DNA同源性序列分析^[8]。

1.3.3 生物量與COD測(cè)定。生物量用光密度OD600表示，COD的測(cè)定用重鉻酸鉀法^[9]。

1.3.4 NG3菌株的生長(zhǎng)及降解特性。

采用正交試驗(yàn)法研究高效降解菌NG3菌株的生長(zhǎng)及降解特性^[10]。其正交試驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

2.2.2 NG3菌株核酸序列同源性比較。

將NG3菌株16SrDNA測(cè)序結(jié)果輸入GenBank中，利用Blast軟件進(jìn)行序列同源性分析，結(jié)果表明，NG3與Acinetobacter（不動(dòng)桿菌屬）的大多數(shù)菌種的相似度達(dá)到95%以上，其中NG3與菌種Acinetobacter sp.C65的16S rDNA序列相似度達(dá)到99%。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)通過(guò)選擇性富集培養(yǎng)，從高濃度抗生素制藥工業(yè)廢水處理的活性污泥中篩選得到一株具有較高抗生素降解能力的優(yōu)勢(shì)降解菌NG3，經(jīng)染色觀察、形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及

生理生化特征鑒定和16SrDNA序列分析，最終確定NG3菌株為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）。進(jìn)一步的降解研究表明，Acinetobacter sp.NG3菌株的降解作用受溫度影響較敏感，可能是溫度影響NG3菌分泌的降解抗生素的代謝酶的活性，其次是轉(zhuǎn)速，通過(guò)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)速大小直接影響氧氣的供應(yīng)，pH影響最小。最終確定其最佳降解條件為：溫度為35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，初始pH為7.0。Acinetobacter sp.NG3菌株是從自然環(huán)境中篩選獲得的野生型菌株，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后其COD去除率達(dá)到89.5%，作為工業(yè)化大規(guī)模處理抗生素制藥廢水并不一定理想，但可作為出發(fā)菌株，通過(guò)人工誘變育種的方法篩選COD去除率較高的優(yōu)勢(shì)菌株；也可以對(duì)其進(jìn)行基因克隆，利用基因工程的方法構(gòu)建工程菌，以適合大規(guī)模工業(yè)化進(jìn)行抗生素制藥廢水處理的需要。

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