滕德強(qiáng) 崔振昂 楊楠 江濤 呂頌輝

摘要

在前人研究的基礎(chǔ)上， 結(jié)合國內(nèi)外研究進(jìn)展，使用HPLC的色素分析技術(shù)，從萃取劑的選擇、樣品干燥與否、靜置時間以及超聲方式等方面逐步優(yōu)化沉積物中光合色素的萃取方法，完善海洋沉積物中18種光合色素的前處理技術(shù)。

關(guān)鍵詞 光合色素；沉積物；萃取；高效液相

中圖分類號 S931.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）31-10864-03

Research of Extraction Methods for Pothosynthetic Pigments in Sediments

TENG Deqiang1， CUI Zhenang1， YANG Nan1 et al （Guangzhou Marine Geological Survey， Guangzhou， Guangdong 510760）

Abstract Combined with the research progress both at home and abroad on the basis of previous studies， using HPLC pigment analysis technology， the sediments of the photosynthetic pigment extraction method， was optimized from the selection of extraction agent， dry samples or not， incubation time and ultrasonic method， etc. The marine sediments of 18 kinds of photosynthetic pigment preparation technology was improved.

Key words Pothosynthetic pigments； Sediments； Extraction； HPLC

海洋沉積物中光合色素（藻類色素、其他植物色素、細(xì)菌色素）能表征特定生物的種類和來源，作為一種重要的化學(xué)生物標(biāo)志物，即使埋藏到沉積物甚至發(fā)生某些變化后仍保留其源信息^[1]。在過去的幾十年，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，海洋沉積色素在地球化學(xué)、海洋科學(xué)等領(lǐng)域起著越來越重要的作用^[2-3]。

然而，在沉積色素分析的過程中，將色素從樣品中定性、定量地提取到合適的溶劑中起著至關(guān)重要的作用。國內(nèi)外有諸多學(xué)者對沉積色素的提取做過相關(guān)的研究。Zapata等^[4]在探討含吡啶組分的流動相分析方法時，采用的萃取劑是濃度95%甲醇。Fuco等^[3-4]建議不采用冷凍干燥，應(yīng)直接對樣品進(jìn)行萃取，認(rèn)為冷凍干燥會使沉積物中的一部分色素降解^[3-4]。Chen等^[5]對沉積物提取色素時，為了萃取更加完整，加入萃取劑以后，在-20 ℃的冰箱中靜置一夜（約12 h）。BuffanDubau等^[6]也對沉積色素的提取方法進(jìn)行了研究，但由于沉積物類型的多樣性，并沒有適合所有類型沉積物的統(tǒng)一的色素提取方法^[7]。筆者在前人的基礎(chǔ)上對18種沉積色素的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

根據(jù)《海洋調(diào)查規(guī)范》的表層沉積物均采用抓斗式采泥器采集，采樣時間為2011年4月，地點為東海海域（E122°45′，N29°28′59.9″ ，2011年4月在長江口采集的樣品，za5站位），取0～4 cm厚的表層沉積物，用錫紙小心包裹后用封口袋封裝，并且保存于-20 ℃冰柜內(nèi)。

1.2 HPLC參數(shù)設(shè)置

光合色素HPLC方法參考Zapata等^[4]方法，選擇二元梯度洗脫程序，2個流動相分別為A、B，流動相A為甲醇∶乙腈∶吡啶（50∶25∶25，體積比），流動相B為甲醇∶乙腈∶丙酮（20∶60∶20，體積比），流動相配制完成后經(jīng)過全玻璃過濾系統(tǒng)的過濾，濾膜為0.2 μm的有機(jī)相過濾膜。其中，流動相A中吡啶溶液的配制方法如下：取900 ml MilliQ水至1 L燒杯中，加入10 ml醋酸和20 ml吡啶，并且用磁力攪拌器攪拌（轉(zhuǎn)速1 500 r/m），之后逐滴加入醋酸，使pH達(dá)到5.0，再轉(zhuǎn)移到1 L容量瓶中，并用MilliQ水定容至1 L。在流動相A配制完成后，一般選擇在14 d內(nèi)使用。

進(jìn)樣量為100 μl，柱溫箱設(shè)置25 ℃，保持柱溫恒定，二極管陣列檢測器（DAD）檢測波長為430、440和450 nm，設(shè)置帶寬為8 nm。熒光檢測器（FLD）的激發(fā)吸收波長分別為440和650 nm。梯度洗脫程序如表1所示，整個洗脫程序的運行需要47 min。在運行過程中系統(tǒng)流速始終是1 ml/min。

1.3 試驗方案

選用長江口的一個表層沉積物為研究對象，把樣品完全溶化后混勻，分成等份，每份2 g（下述試驗中均使用此等份樣品），冷藏備用。所有樣品的萃取程序相同，取出每份2 g樣品，加入萃取劑之后進(jìn)行超聲萃取，然后冷凍靜置一段時間，離心后取上清液，再把提取物經(jīng)0.45 μm PTFE濾膜（聚四氟乙烯濾膜）針筒濾器過濾，上機(jī)測定（每個條件下均有3個平行樣）。所有操作均在弱光環(huán)境中進(jìn)行，以避免色素降解。

1.3.1 萃取劑的選擇。取出冷藏樣品，分別用3 ml濃度80%、90%、95%以及100%的丙酮和濃度80%、90%、95%以及100%的甲醇萃取。除了選取的萃取劑不同，其余萃取程序過程相同，萃取過濾后上機(jī)測定。

1.3.2 干法與濕法的比較 。

取出冷藏的備用樣品，其中一半在-50 ℃冷凍干燥機(jī)里冷凍干燥，并且分別用3 ml濃度95%丙酮對冷凍干燥和非冷凍干燥的樣品進(jìn)行萃取，其余萃取程序過程相同，萃取過濾后上機(jī)測定。

1.3.3 靜置時間的比較。

取出冷藏備用樣品，每份均加入3 ml濃度95%丙酮試劑，加入萃取劑之后避光冷藏保存0、3、6、12、24以及36 h，再經(jīng)離心、過濾等處理后，上機(jī)測定各色素含量。

1.3.4 探頭超聲與水浴超聲對比。

取出冷藏備用樣品，每份均加入3 ml濃度95%丙酮試劑，加入萃取劑之后，分別對樣品超聲萃取。超聲分為水浴超聲和探頭超聲，其中水浴超聲時間梯度為2.5、5.0、7.5和10.0 min 4個時段。探頭超聲時間梯度為30、60、120和240 s 4個時段。無論是探頭超聲還是水浴超聲，在超聲時均要在冰水混合物中進(jìn)行，除了超聲方式和超聲時間另外設(shè)置外，其余萃取程序過程相同，萃取過濾后上機(jī)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取劑的選擇

由圖1～3可知，在丙酮的4個梯度，除濃度90%丙酮對19Hexfucoxanthin和pheophytin a以及濃度100%丙酮對葉綠素a的萃取效率略高于濃度95%丙酮萃取效率外，其他色素在濃度95%丙酮中萃取效果最好，其次是濃度90%丙酮、濃度80%丙酮與濃度100%丙酮萃取效果最差；在甲醇的4個梯度中，整體而言濃度90%甲醇的萃取效果最好，盡管青綠黃素、硅藻黃素、葉黃素以及葉綠素a和脫鎂葉綠素a在濃度100%甲醇中萃取效果更好，濃度 95%甲醇與濃度100%甲醇的萃取效果相當(dāng)，但次于濃度90%甲醇的萃取效果，而濃度80%甲醇的萃取效果最差。通過對比丙酮和甲醇的提取效率，發(fā)現(xiàn)濃度95%丙酮在丙酮梯度中萃取效果最好，而濃度90%甲醇在甲醇梯度中萃取效果最好，但整體效果而言濃度95%丙酮要遠(yuǎn)勝于濃度90%甲醇的萃取效果（青綠黃素和硅甲藻黃素除外），尤其是紫黃素、葉綠素a等極性較強(qiáng)的色素，濃度95%丙酮的萃取效率遠(yuǎn)高于濃度90%甲醇。因此，該研究最終所選取的萃取劑為濃度95%丙酮。

2.2 干法與濕法的比較 由圖4可知，葉綠素c2、葉綠素a以及紫黃素不采用冷凍干燥，直接進(jìn)行萃取的效果要好，經(jīng)干燥處理后這幾種色素含量有一定的下降趨勢，但其他色素在冷凍干燥后萃取效果顯著改善。葉綠素c2、葉綠素a以及紫黃素經(jīng)冷凍干燥后萃取效率降低的原因可能是它們極性較強(qiáng)，在冷凍干燥過程中接觸到空氣，發(fā)生氧化分解等降解反應(yīng)。至于總體上冷凍干燥后樣品的萃取效率遠(yuǎn)高于濕沉積物的直接萃取，原因可能是濕沉積物含有大量的水分，致使丙酮不易穿透水膜，沉積物里面的色素得不到完全的萃取。根據(jù)試驗結(jié)果分析，該研究在沉積色素的前處理過程中采用冷凍干燥法處理樣品。

2.3 靜置時間的比較 由圖5可知，具有一定極性的葉綠素 c2、葉綠素a、紫黃素和硅甲藻黃素在靜置12 h時效果最好，超過12 h時檢測到的色素含量明顯降低。多甲藻黃素和新黃素在靜置6 h時萃取效果最好，在靜置12 h時色素含量降低，色素有所損失。玉米黃素靜置6 h效果已達(dá)到最好，隨著靜置時間的增加，色素含量趨于平穩(wěn)。而脫鎂葉綠素a和β胡蘿卜素在靜置24 h時才達(dá)到最大值，其余色素如巖藻黃素、青綠黃素、19-乙酰基氧化巖藻黃素、capsanthin、別藻黃素、硅藻黃素和葉綠素 b等色素在靜置12 h時效果已達(dá)最好，但超過12 時葉綠素 c2、葉綠素a、紫黃素等出現(xiàn)降解現(xiàn)象，因此12 h是最理想的靜置時間。

2.4 探頭超聲與水浴超聲對比

由圖6～8可知，葉綠素 c2、多甲藻黃素、新黃素、紫黃素、硅甲藻黃素以及葉綠素 a等色素可能因為此色素具有一定的極性，隨著水浴超聲時間的延長，在水浴5 min時萃取效果最好，但超過5 min萃取效率降低；19-乙?；趸瘞r藻黃素、玉米黃素、canthaxanthin和葉綠素 b在水浴5 min時效果最好，即使水浴時間延長，其含量也沒有發(fā)生變化；硅藻黃素在水浴7.5 min時效果最好；而巖藻黃素、青綠黃素、capsanthin、別藻黃素、葉黃素、脫鎂葉綠素a和β胡蘿卜素受時間的影響較小，隨著時間的增加其含量并沒有增加或減少。整體而言，水浴5 min效果最好。在探頭超聲的試驗中，同樣是極性較強(qiáng)的色素在30 s時萃取效果最好，且隨著時間的增加其含量降低，尤其是葉綠素 c2、多甲藻黃素和葉綠素a色素含量降低較顯著；而青綠黃素、capsanthin、別藻黃素、硅藻黃素、canthaxanthin、葉綠素 b、脫鎂葉綠素a和β胡蘿卜素等色素在探頭超聲60 s時效果最好，之后隨時間的增加其含量無變化；而巖藻黃素、19-乙?；趸瘞r藻黃素、玉米黃素和葉黃素不受時間的影響，色素含量隨時間的變化并沒有發(fā)生明顯的變化；從整體分析來看，探頭超聲60 s時萃取效果最好。在水浴超聲中5 min水浴超聲效果最好，在探頭超聲中60 s探頭超聲效果最好；對二者進(jìn)行比較，除個別色素外，5 min水浴超聲的效果遠(yuǎn)比60 s探頭超聲的效果要好。這可能是探頭超聲中的探頭要與樣品接觸，并且在超聲時空氣會與樣品接觸，導(dǎo)致樣品中的色素隨探頭拿出而損失或因空氣的接觸而降解。因此，該研究在前處理過程中選取超聲萃取方式為水浴超聲5 min。

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