魏萬敏

【摘要】目的 探討大蒜素對人白血病細胞系K562細胞增殖和凋亡的影響及其機制。方法 體外培養(yǎng)的K562細胞，用不同濃度大蒜素處理24、48、72h，MTT法測定其對K562細胞增殖的影響；大蒜素（濃度分別為3、6、12μg/mL）處理K562細胞48h后，分別采用流式細胞儀檢測細胞凋亡、Rh123探針染色流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化、分光光度計檢測Casepase-3、Casepase-9相對活性、western blot法檢測環(huán)氧合酶2（COX-2）表達情況。結(jié)果 大蒜素（濃度2~32 μg/mL）能抑制K562細胞的增殖，呈劑量和時間依賴性；大蒜素（濃度分別為3、6、12 μg/mL）作用K562細胞48 h后，細胞凋亡率分別為11.5%、21.4%、36.6%，對照組凋亡率為2.2%；Casepase-3、Casepase-9相對活性顯著增加；COX-2的表達降低，呈劑量依賴性。結(jié)論 大蒜素能抑制K562細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機制可能與下調(diào)COX-2基因的表達、增加細胞Casepase-3、Casepase-9活性及降低線粒體膜電位有關(guān)。大蒜素是一種前景廣闊的抗腫瘤藥物。

【關(guān)鍵詞】大蒜素；K562細胞；Caspase-3；Caspase-9；環(huán)氧合酶-2

【中圖分類號】R722.12 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949(2014)07-0141-01

大蒜素（Allicin）是大蒜中最重要的有效成分，其具有廣泛的生物學(xué)作用，包括抗菌、抗炎、抗血栓、降血壓、降血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫力等。流行病學(xué)表明，大蒜素的攝入能減少多種腫瘤的發(fā)生［1］；動物和細胞實驗研究證實，大蒜素在體內(nèi)外對多種腫瘤包括皮膚癌、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、食管癌、胃癌及前列腺癌等均有抗腫瘤作用［2］。為探討大蒜素對血液系統(tǒng)腫瘤的的影響及其機制，本研究以人白血病細胞系K562細胞為對象，觀察大蒜素對人白血病細胞系K562細胞增殖、凋亡的影響，并檢測大蒜素對K562細胞線粒體膜電位、Caspase-3、Caspase-9活性變化及western blot檢測環(huán)氧合酶-2（COX-2）蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人白血病細胞系K562細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫；大蒜素注射液購于山西普德藥業(yè)股份有限公司（30 mg/支）；MTT、羅丹明123（Rhodamine 123, Rh123）購于sigma公司；IMDM培養(yǎng)液、胎牛血清系GIBCO產(chǎn)品；AnnexinV /PI試劑盒、Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所；COX-2單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；辣根酶標記鼠抗山羊IgG購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) K562細胞培養(yǎng)于IMDM培養(yǎng)液中（10％小牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素），置于37℃，飽和濕度，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)生長情況3~5 d傳代一次。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的K562細胞，以1×104/ml的濃度、每孔200 μl接種于96孔板，待細胞貼壁后分為實驗組和對照組，實驗組分別加入大蒜素終濃度為2、4、8、16、32 μg/mL的培養(yǎng)液，對照組加入等量的培養(yǎng)液，并設(shè)立調(diào)零孔。每組設(shè)5個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h，實驗結(jié)束前4 h每孔加入加入20 μl MTT試劑，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，然后小心吸掉上清，每孔加150 μl DMSO，搖床上振蕩10min使結(jié)晶充分溶解，酶標儀檢測570 nm處的吸光值（A值），抑制率=［1-(實驗組平均A值-調(diào)零孔A值)/(對照組平均A值-調(diào)零孔A值)］×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡取對數(shù)生長期細胞，制成單細胞懸液，以1×106/ml濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，貼壁后分為實驗組和對照組，實驗組分別加入大蒜素終濃度分別為3、6、12 μg/mL的培養(yǎng)液，對照組加入等量培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，收集細胞，離洗固定后加入AnnexinV-FITC 和PI染色。篩網(wǎng)過濾送流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4分光光度法檢測Caspase-3、Caspase-9活性變化 細胞接種及分組同上，培養(yǎng)48 h后，收集細胞，分別加入50 μl冷裂解緩沖液，冰浴裂解15 min，然后4 ℃，1200r/min離心15 min，將上清移至預(yù)冷的離心管中，置于冰上，取5 μl用BCA法測定蛋白濃度，取50 μl調(diào)好蛋白濃度（2~4 g/L），加入20 μl反應(yīng)緩沖液吹打均勻，加入5 μl Caspase-3、Caspase-9反應(yīng)底物Ac-DEVD-pNA和Ac-LEHD-pNA，細胞培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，酶標儀上405 nm處測定吸光度（OD405）。

1.2.5 Rh123染色流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位水平 細胞接種及分組同上，收集細胞，PBS漂洗3次，重懸于1 ml的1μg/ml Rh123中，放置培養(yǎng)箱中孵育30 min。PBS洗滌3次，用EPICS-XL型流式細胞儀以507 nm為激發(fā)波長，529 nm為發(fā)射波長測定細胞內(nèi)熒光強度。

1.2.6 western blot檢測COX-2蛋白表達變化 細胞接種及分組同上，收集細胞，用PBS漂洗，參照細胞漿蛋白抽提試劑盒說明書進行操作，提取細胞總蛋白，并測定蛋白濃度，蛋白樣品加入1/5體積的5×上樣緩沖液，沸水煮沸5min后離心，以每孔20 μg/孔上樣，行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入1:1000稀釋的鼠抗人COX-2蛋白，4℃過夜，β-actin作為內(nèi)參，TBST洗膜3次，加入1:1000稀釋的辣根酶標記的兔抗山羊IgG，室溫孵育2h，同樣洗膜3次，ECL顯色，觀察各條帶深淺變化。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 所有資料經(jīng)SPSS17.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件處理，計量資料以（X±s）表示，兩樣本間參數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，以P < 0. 05 為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素對K562細胞增殖的影響

MTT法檢測顯示，大蒜素能顯著抑制K562細胞增殖，且隨著大蒜素濃度的增加和作用時間的延長，其抑制作用逐漸增強，呈明顯的濃度和時間依賴效應(yīng)（表1）。

表1 大蒜素對K562細胞增殖的影響（X±s）

2.3 大蒜素對K562細胞凋亡的影響

大蒜素（濃度分別為3、6、12 μg/mL）處理K562細胞48 h后，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示細胞凋亡率分別為11.5%、21.4%、36.6%，而對照組凋亡率僅為2.2%，表明大蒜素能誘導(dǎo)K562細胞凋亡（圖1）。

2.4大蒜素對細胞線粒體膜電位的影響

Rh123染色流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位結(jié)果顯示，不同濃度大蒜素處理48 h后，K562細胞線粒體熒光強度隨著藥物濃度的升高逐漸降低（P<0.05）（圖2），而Rh123熒光強度值可反映線粒體膜電位（MMP）相對強度。表明大蒜素能降低K562細胞線粒體膜電位的作用。

2.5大蒜素對K562細胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響

Caspase-3、Caspase-9活性檢測示3、6、12 μg/mL大蒜素作用K562細胞48 h后，Caspase-3相對活性明顯升高，分別為0.194±0.02、0.253±0.04和0.316±0.03，與對照組（0.113±0.02）比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Caspase-9活性亦明顯升高，分別為0.177±0.02、0.234±0.03和0.305±0.04，與對照組（0.105±0.02）比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明大蒜素能升高K562細胞Caspase-3、Caspase-9活性（圖3）。

2.6大蒜素對K562細胞COX-2蛋白表達的影響

大蒜素作用K562細胞48 h后，結(jié)果顯示隨著大蒜素濃度的升高，COX-2蛋白表達量逐漸降低，結(jié)果見圖4。

3 討論

細胞凋亡是多細胞機體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的自我調(diào)節(jié)機制，細胞凋亡與細胞增殖之間的平衡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用［3］，細胞凋亡是程序化、多基因調(diào)控的細胞死亡過程，通過誘導(dǎo)細胞凋亡已經(jīng)成為抗腫瘤研究的熱點。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素在2~32 μg/mL濃度范圍均能抑制K562細胞的增殖，且隨著藥物濃度的升高和作用時間的延長，其抑制作用亦逐步增強，呈明顯的濃度效應(yīng)及時間效應(yīng)。流式細胞儀檢測顯示，大蒜素處理后，K562細胞出現(xiàn)明顯的凋亡，且細胞凋亡率隨藥物濃度的升高而增加，呈明顯的濃度依賴效應(yīng)。表明大蒜素可抑制K562細胞的增殖及誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

在細胞凋亡的機制研究中，線粒體在各種凋亡過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。正常細胞中線粒體膜電位維持在一定水平，當線粒體膜電位耗散時，線粒體呼吸鏈受損，ATP合成受抑制，線粒體釋放細胞色素C等線粒體蛋白，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)和其他凋亡相關(guān)蛋白，伴隨ROS水平升高，使DNA斷裂，并產(chǎn)生凋亡小體，導(dǎo)致細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度大蒜素處理48 h后，K562細胞內(nèi)線粒體熒光強度隨著藥物濃度的升高逐漸降低，即線粒體膜電位（MMP）相對強度降低，且線粒體膜電位降低趨勢與細胞凋亡率增加趨勢一致，表明大蒜素可能通過下降線粒體膜電位觸發(fā)細胞凋亡的發(fā)生。

Caspase家族的激活在細胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用，被認為是引起凋亡的直接效應(yīng)物。Caspase-9是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白酶，處于Caspase“瀑布式”激活的頂端，它的活化對線粒體凋亡通路尤為重要，并進一步激活Caspase-3，Caspase-3活化后可裂解DNA修復(fù)相關(guān)分子、凋亡抑制蛋白、細胞外基質(zhì)蛋白和骨架蛋白等，促進細胞凋亡。Caspase-3是凋亡過程的主要效應(yīng)分子，其活化標志著凋亡進入不可逆階段。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素作用K562細胞48 h后，細胞Caspase-3、Caspase-9活性明顯升高，并呈明顯濃度依賴效應(yīng)，提示大蒜素可能通過激活Caspase-3、Caspase-9級聯(lián)的線粒體依賴性途徑誘導(dǎo)K562細胞凋亡。

COX-2是前列腺素（prostaglandins, PG）特別是前列腺素E2（PGE2）合成過程的重要限速酶，研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在腫瘤包括結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌、胰腺癌及頭頸部腫瘤等腫瘤中過表達。COX-2能通過促進細胞惡性轉(zhuǎn)化、抑制細胞凋亡、促進腫瘤血管新生、抑制抗腫瘤免疫等機制參與多種腫瘤發(fā)生、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等［4］，因此，COX-2被認為是抗腫瘤的一個靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素能下調(diào)COX-2表達，提示這可能是大蒜素的作用機制之一。

綜述所述，本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可抑制K562細胞增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生細胞凋亡，其機制可能與下調(diào)COX-2表達，并增加細胞Caspase-3、Caspase-9活性，并降低線粒體膜電位，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡。腫瘤的凋亡是一個復(fù)雜而又精確調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，大蒜素誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)信號通道，是我們下一步要進行的工作。

圖1流式細胞儀檢測大蒜素對K562細胞凋亡率的影響

(a) control; (b)3 μg/mL; (c) 6 μg/mL; (d) 12 μg/mL

圖2大蒜素對K562細胞線粒體膜電位的影響（#P<0.05）

圖3大蒜素對K562細胞Caspase-3、Caspase-9相對活性的影響

圖3大蒜素對K562細胞COX-2表達的影響

參考文獻

［1］Milner JA. A historical perspective on garlic and cancer ［J］. J Nutr, 2001, 131(3s): 1027S-1031S

［2］ Zha S, Nelson W G, et al. Cyclooxygenases in cancer: progress and perspective ［J］. Cancer Lett, 2004, 215(1): 1-20

［3］Wang D, Dubois RN. Eicosanoids and cancer ［J］. Nat. Rev. Cancer, 2010, 3,181–193.

［4］李杰，楊紅，郝洪嶺. 環(huán)氧合酶-2與腫瘤研究進展［J］. 臨床誤診誤治，2012, 25(4): 73-75