張碧海 江柏華 蔣鵬娜 譚莉君

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·150036）

呼吸道感染有正粘病毒科中的流感病毒甲、乙、丙型，副粘病毒科中的呼吸道合胞病毒、副流感病毒等以及其它的腺病毒等，分別為單負(fù)股RNA病毒和雙股DNA無(wú)包膜病毒，均能引起上下呼吸道等多種疾病[1]。對(duì)病毒性感冒尚無(wú)有效的治療措施，本研究利用我院的院內(nèi)制劑金石清瘟解毒口服液，選用流感病毒B型和腺病毒(AdV3)分別在MDCK細(xì)胞系和HeLa細(xì)胞系上進(jìn)行體外病毒抑制作用的研究，測(cè)定該藥物的抗病毒譜，以及50%藥效劑量(IC50)治療指數(shù)(TI值)，現(xiàn)報(bào)道結(jié)果如下：

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物

將金石清瘟解毒口服液50ml溶解于100ml無(wú)菌雙蒸水中，除菌過(guò)濾，無(wú)菌試驗(yàn)72h -4℃保存待測(cè)。西藥對(duì)照：利巴韋林注射液(滬衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1995)第0071070號(hào)，中國(guó)信誼藥廠)，規(guī)格1ml裝(100 mg)。

1.2 病毒

甲型流感病毒為本室凍干毒種，接種在8-12天齡雞胚尿囊腔上傳代，72 h后取尿囊液其血凝效價(jià)是1：1280,再將尿囊液在MDCK細(xì)胞滴定50%組織細(xì)胞感染劑量(TCID50)為10-5.4，AdV3來(lái)源于黑龍江省疾病控制中心病毒研究所，在HeLa細(xì)胞傳代后滴定TCID50為10-6.5，兩毒種分裝后貯存-84℃?zhèn)溆?/p>

1.3 細(xì)胞

MDCK細(xì)胞傳代株及HeLa細(xì)胞傳代株為黑龍江省疾病控制中心病毒研究所凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要設(shè)備

倒置生物顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)，CO2無(wú)恒溫培養(yǎng)箱(日本大和科學(xué)株式會(huì)社)，-85℃超低溫冰箱(日本三洋公司)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)BD公司)等。

2 方法

2.1 藥物對(duì)MDCK和HeLa細(xì)胞毒性測(cè)定

將上述制備藥液，用無(wú)血清的DMEM液10倍系列稀釋后接種于已形成單層的MDCK和HeLa細(xì)胞孔中，每孔100μl，每一個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，以DMEM液作正常細(xì)胞對(duì)照,37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察CPE，以“+—++++”記錄結(jié)果，按Reed-Muench法[2]計(jì)算藥物的半數(shù)中毒濃度(TD50)和最大無(wú)毒濃度(TD0)[3]。西藥對(duì)照藥利巴韋林以同法同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。

2.2 藥物對(duì)流感病毒B型和腺病毒(AdV3)抑制作用

MDCK細(xì)胞和HeLa細(xì)胞各5×108/L，每孔100μl，分別于96孔板中，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日傾去孔中培養(yǎng)液.分別加入100 TCID50流感病毒B型于MDCK細(xì)胞孔中和100 TCID50 AdV3于HeLa細(xì)胞孔中，每孔100μl,37℃吸附lh后甩去上清，用PBS液洗2次，用二種藥物的最大無(wú)毒濃度(TD0)為第一孔，再以無(wú)血清的DMEM液作2倍系列稀釋6個(gè)濃度，分別加入上述已感染細(xì)胞孔內(nèi)，每孔100μl,每個(gè)濃度重復(fù)4孔，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)系列分別設(shè)立藥物對(duì)照，細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照,37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，倒置顯微鏡下每日觀察CPE進(jìn)展，以藥物對(duì)照(-)，細(xì)胞對(duì)照(-)病毒對(duì)照CPE“++++”時(shí)計(jì)算結(jié)果50%抑制濃度。流感病毒B型在MDCK細(xì)胞上CPE特征為單層細(xì)胞變性變圓,AdV3在HeLa細(xì)胞為細(xì)胞腫脹變圓，折光度增強(qiáng)，聚集成不規(guī)簇狀，固定染色后拍照。

2.3 藥物治療指數(shù)(n)按TI =TD50/ID50進(jìn)行計(jì)算[3],TI值愈大,表明藥物的安全范圍愈大。

3 結(jié)果

3.1 藥物對(duì)MDCK和HeLa細(xì)胞毒性作用以藥物半數(shù)中毒量TD50和最大無(wú)毒量TD0來(lái)表示結(jié)果，見(jiàn)表l。

表l 藥物對(duì)MDCK細(xì)胞和HeLa細(xì)胞毒性作用(mg/L)

可見(jiàn)二種藥物高濃度時(shí)對(duì)MDCK和HeLa細(xì)胞均有一定毒性。試驗(yàn)結(jié)果表明藥物抗病毒中用藥物最大無(wú)毒量TD0，金石清瘟解毒口服液為50 mg/L、利巴韋林100 mg/L,以此濃度排除藥物本身毒性對(duì)細(xì)胞影響，以保證結(jié)果的正確和可靠。

3.2 藥物對(duì)流感病毒B型和AdV3的抑制作用及TI值大小

將金石清瘟解毒口服液和利巴韋林藥分別作2倍系列稀釋后，對(duì)100 TCID50流感病毒B型和AdV3進(jìn)行抑制試驗(yàn)，計(jì)算藥物對(duì)病毒抑制百分率及半數(shù)有效量IC50及TI值大小。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 藥物對(duì)流感病毒B型和AdV3的IC50及治療指數(shù)TI

4 討論

急性呼吸道感染90%以上是由呼吸道病毒引起，大都為RNA病毒。流感病毒B型為流感病毒的一個(gè)亞型，由于流感病毒易不斷發(fā)生抗原變異，預(yù)防性注射疫苗效果不夠理想[4],對(duì)流感尚缺乏有效的藥物。而AdV3是雙股DNA病毒，最早是在原發(fā)性非典型肺炎患者的呼吸道標(biāo)本接種于HeLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，亦可造成不同人群中咽、結(jié)膜炎性發(fā)熱性的流行[4]。本試驗(yàn)所選兩種病毒分屬RNA和DNA類(lèi)病毒，測(cè)定其抗病毒譜的范圍。本研究并嚴(yán)格按照衛(wèi)生部藥政局《新藥臨床前研究指導(dǎo)原則》的要求，以微量細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行藥物抗病毒試驗(yàn)，具有靈敏度高、便于觀察、材料用量少、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)中選擇了兩種病毒和其對(duì)應(yīng)的敏感MDCK和HeLa細(xì)胞株，并設(shè)立西藥利巴韋林為對(duì)照組，每組還設(shè)藥物對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照及病毒對(duì)照，使觀察的結(jié)果規(guī)范，具有良好可比性，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次(n=3)結(jié)果一致以藥物定量反應(yīng)法反應(yīng)穩(wěn)定。對(duì)RNA病毒流感病毒和DNA病毒AdV3之間IC50基本相似，說(shuō)明該中藥與利巴韋林對(duì)RNA和DNA病毒均同樣具有較廣的抗病毒譜。本研究?jī)H對(duì)一種DNA病毒在體外細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)其它DNA病毒作抗病毒試驗(yàn)，以確定其抗病毒譜。至于體內(nèi)藥效是否與體外結(jié)果一致有待進(jìn)一步研究。

[1] 周漢良,陳秀強(qiáng).呼吸藥理學(xué)與治療學(xué)[M].第l版，北京：人民衛(wèi)生出版杜.1998：604

[2] 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病防治所編.常見(jiàn)病毒實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版讓.1978：34-77

[3] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局 抗病毒藥效指導(dǎo)原則新藥（西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編1993.164-179

[4] 顧方舟,曹逸運(yùn),董德祥,等譯.病毒、立克次體及衣原體疾病診斷技術(shù)[M].第6版，北京：北京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社.1993：516-517.177-179.